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CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and their associated genes)是一种原核生物的获得性免疫系统,分布于约40%细菌和90%古菌中。CRISPR的特征是,来自外源核酸的各种间隔序列(spacer)将重复序列(repeat)分开。根据Cas复合体的核心蛋白结构的差别,CRISPR-Cas可分为2类6型19种亚型。CRISPR-Cas行使免疫功能分为三个步骤:获取外源DNA作为间隔序列(Spacers);转录CRISPR并加工成成熟的crRNA;通过含有Spacer的成熟CRISPR RNA(crRNA)与外源核酸的碱基配对,介导Cas复合体对目标核酸切割、降解。然而,第三型(Type III,包括Cmr和Csm亚型)是唯一的既能切割外源DNA又能切割外源RNA的CRISPR-Cas系统。现有研究表明Cmr或Csm复合物中crRNA与目标mRNA碱基互补配对后,激活Cas10亚基的DNA切割活性并切割由RNA聚合酶产生的ssDNA,目标mRNA则被Cmr(Csm)复合物中Cmr4(Csm3)以6-nt为间隔切割。虽然Type III切割目标核酸的机制有了较为彻底的研究,但是crRNA的长度和Cmr复合物的完整性对RNA干涉效率的影响尚未报道,而且非Cmr复合物蛋白对Cmr复合物核酸干涉效率的影响也不确定。本文研究的对象冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)E233S编码两型CRISPR-Cas系统,即Type I-A,Type III-B(Cmr-α和Cmr-β)。其中Type I-A系统只有DNA干涉活性,Type III-B Cmr-β系统只有RNA干涉活性,而Type III-B Cmr-α两者兼具。本文以冰岛硫化叶菌Cmr-β系统缺失株(S.islandicusΔcmr-β)为出发菌株,开展了一系列的遗传学分析,获得以下几个方面的成果:(1)由于在98kb片段缺失菌株(Δ98kb E233S)中互补核酸酶Csx1的基因能恢复Cmr-α系统的DNA干涉活性。于是检测?cmr-β菌株背景下获得的csx1基因缺失株的核酸干涉活性,但发现csx1基因的缺失并不影响Cmr-α系统的核酸干涉活性。所以在缺失菌的98kb片段中还有其他基因影响Cmr-α系统的核酸干涉活性,如csm6,csxPIN。(2)Cmr-α复合体由Cmr-α1-6共6个亚基组成。检测发现?cmr-β菌株背景下获得的cmr6基因缺失株的RNA干涉活性不变,表明该亚基的缺失并不影响Cmr-α系统的RNA干涉活性。(3)设计不同长度spacer的mini-CRISPR(最简CRISPR阵列)质粒,并将其转入?cmr-β菌株中。通过检测获得的菌株的RNA干涉活性,发现能发生RNA干涉的最短spacer长度为32bp(野生型为40nt),过长的spacer并不会影响Cmr-α系统的RNA干涉活性。(4)在mini-CRISPR质粒的spacer上设计不同的突变,并将其转入?cmr-β菌株中。通过检测获得的菌株的RNA干涉活性,发现spacer的第25bp到30bp的突变会严重影响Cmr-α系统的RNA干涉活性。因此推断Cmr-α系统的种子序列在spacer的第25nt到30nt之间。综上所述,Cmr-α复合体在冰岛硫化叶菌体内的核酸切割时,Cmr-α复合体亚基Cmr6α和核酸酶Csx1是非必须的,但需要核酸酶的参与。而且过短的crRNA或种子序列不匹配,会直接导致RNA干涉活性降低。