目的:　　 缺氧是一种重要的病理状态,其与肿瘤生长微环境的关系更是近年的热点,在恶性肿瘤的发生和发展等个环节中发挥重要作用。粘附分子与肿瘤的侵袭转移有着密不可分的关系。本研究模拟细胞缺氧微环境并通过上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,继而调控粘附分子E-cadherin、integrinα5,integrinβ6的表达而促进胃癌的侵袭和转移。并进一步以中药单体提取物薯蓣皂苷元(Dio,diosgenin)进行干预,观察薯蓣皂苷元在改善肿瘤细胞缺氧微环境,调控胃癌癌粘附分子,抑制肿瘤生长及防治胃癌侵袭转移方面的作用机制。　　 方法:　　 1、复苏并且培养人胃癌细胞NCI-N87,HGC-27,MGC80-3,SGC-7901,BGC823,对这些人胃癌细胞系进行厌氧诱导,收集样本,通过Real Time-PCR的方法进行HIF-1α mRNA表达状况检测。　　 2、使用shRNA质粒表达载体对目的基因HIF-1α进行siRNA重组表达载体构建。经测序正确的siRNA序列对应的重组表达载体进行去内毒素质粒DNA抽提,使用siRNA重组表达载体质粒DNA转染293细胞；使用Real-time PCR和Westernblot的方法检测转染后细胞中HIF-1α基因表达状况。使用病毒包装系统(pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit)进行慢病毒颗粒的包装和生产；测定病毒滴度(梯度稀释法)。预实验确定慢病毒对于BGC823细胞感染的最佳MOI值；BGC823-HIF-1α RNAi稳定表达细胞株制作(单细胞培养法)；Real Time-PCR检测感染后BGC823细胞(缺氧诱导)中HIF-1α基因的表达状况；Western blot检检测感染后BGC823细胞(缺氧诱导)中HIF-1a蛋白的表达状况。　　 3、使用MTT确定薯蓣皂苷元的药物剂量(IC50值)；使用薯蓣皂苷元高、中、低剂量组干预后HIF-1α、E-cadherin、integrinα5、integrinβ6 mRNA以及蛋白表达；检测细胞处理后侵袭能力变化。　　 结果：　　 1、缺氧敏感细胞株的筛选分别检测的5株胃癌细胞株:NCI-N87,MGC80-3,SGC-7901,BGC823在厌氧处理前后,HIF-1α基因的mRNA与蛋白表达量,并与正常环境培养组相比较明显上升,且差异显著(P<0.05),其中BGC823细胞中,HIF-1α基因的mRNA与蛋白表达上升最为明显(P<0.01)。　　 2、针对HIF-1α基因的siRNAshRNA重组质粒构建及有效序列的筛选表达HIF-1α基因的shRNA模板片段与载体连接后进行RT-PCR检测,与理论值相符。mRNA检测结果显示,三条siRNA序列对目的基因均有RNAi效果,其中,效果最好的一条为3号序列:5’-GTAGTGCTGACCCTGCACT-3’,其对于目的基因的沉默效果>90％。Western blotting检测结果与定量的结果完全一致。使用siRNA3序列对应质粒进行慢病毒包装,通过预实验,得到了BGC-823细胞的慢病毒感染最佳MOI值=7。按照最佳MOI值,BGC-823细胞感染72小时后荧光趋于稳定。通过荧光显微镜计数,细胞的感染效率>99％。　　 3、MTT法检测添加不同浓度薯蓣皂苷元后细胞抑制率使用公式法求的薯蓣皂苷元对于BGC823细胞的IC50=52.013±0.9445μM　　 4、薯蓣皂苷元对沉默HIF-1α基因前后,胃癌BGC-823细胞粘附分子的影响薯蓣皂苷元与HIF-1α-RNAi分别干预可降低缺氧状态胃癌细胞HIF-1α mRNA表达,使用薯蓣皂苷元高剂量30μM+HIF-1α-RNAi进行干预后HIF-1α mRNA表达相较cell+缺氧组下降最明显(P<0.05),薯蓣皂苷元10μM+HIF-1α-RNAi干预组,薯蓣皂苷元1μM+HIF-1α-RNAi干预组HIF-1αmRNA表达相较cell+缺氧组也均有下降,且存在剂量依赖性,各组间P值均小于0.05,差异有统计学意义。此外integrinβ6mRNA与HIF-1α mRNA的变化趋势相同,其中cell+缺氧组对于cell组的升高P值小于0.05,差异有统计学意义,对于其他组之间的比较,P值均大于0.05,差异无统计学意义。E-cadherin mRNA与integrinα5 mRNA的表达在细胞缺氧处理后相较正常环境细胞均有下降,使用薯蓣皂苷元+HIF-1α-RNAi干预后表达均上升,其中薯蓣皂苷元高剂量30uM时升高最明显,与其他各组比较(P<0.01),并存在剂量依赖性。使用Western blotting的方法对缺氧处理前后肿瘤细胞中HIF-1α蛋白表达量进行检测,分别在在132kDa,120kDa,150kDa,138kDa,处分别清楚找到目的蛋白条带,依次对应HIF-1α、E-cadherin、integrinα5、integrinβ6蛋白,过对目的条带进行灰度值分析,变化趋势与RT-PCR检测结果基本一致。分析说明,缺氧环境处理对的胃癌细胞BGC823中integrinα5,integrinβ6,E-cadherin蛋白的表达有明显影响,HIF-1α基因沉默(RNAi)与薯蓣皂苷元均可改变缺氧对蛋白表达的影响趋势,二者共同存在时作用更为明显。　　 5、细胞迁移检测结果使用细胞侵袭检测试剂盒进行BGC823细胞侵袭能力检测。使用荧光分析法对穿过膜的细胞进行数量分析,细胞缺氧后细胞数明显高于正常环境组,提示细胞侵袭力增强,药物干预组细胞数均降低,其中薯蓣皂苷元和HIF-1α-RNAi联合干预,下降最明显,其P值均小于0.05,差异有统计学意义。　　 结论：　　 1、在多数胃癌细胞中,缺氧处理可以诱导HIF-1α基因表达的上调；　　 2、通过慢病毒实验系统,我们通过RNAi方法在BGC823胃癌细胞株实现了对HIF1α基因的高效,长期,稳定沉默；　　 3、薯蓣皂苷元对缺氧环境中的胃癌细胞BGC823活性具有抑制作用；　　 4、HIF-1α基因沉默(RNAi)后,相比较沉默前,薯蓣皂苷元对缺氧环境中的胃癌细胞BGC823侵袭能力抑制作用更加明显；　　 5、缺氧环境处理对的胃癌细胞BGC823中integdnα5,integrinβ6,E-cadherin蛋白的表达有明显影响,HIF-1α基因沉默(RNAi)与薯蓣皂苷元均可改变缺氧对蛋白表达的影响趋势,从而抗胃癌的侵袭转移,二者共同存在时作用更为明显。