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背景:心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是高血压与心肌梗死等多种常见心血管疾病向终末期心脏病发展的重要过程,是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键机制之一。目前临床用药难以逆转纤维化进程,因此研发新的抗纤维化药物对降低死亡率、提高生存质量具有重要意义。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,是黄芩的主要有效成分之一,具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态反应、清除氧自由基及解痉等多种药理作用。目前黄芩苷在治疗心血管疾病方面成为研究热门,已经明确的心血管药理作用有抗动脉粥样硬化、抑制内皮细胞功能障碍、保护心肌缺血再灌注损伤等。然而到目前为止,有关于黄芩苷在心肌纤维化方面的药理作用和具体作用机制还知之甚少,缺少相关的研究报道。许多研究表明黄芩苷可以改善多种器官纤维化,如肝纤维化、肺纤维化与肾纤维化。由于纤维化病变的主要病理变化为组织损伤后瘢痕修复使组织结构紊乱,引起器官或组织功能丧失,且所有器官的纤维化病变都具有相似的组织学异常变化,因此黄芩苷具有抗心肌纤维化药理作用的假设存在较大可行性,值得进一步研究。目的:在体外采用AngⅡ诱导原代乳鼠成纤维细胞增殖,体内采用AAC模型诱导SD大鼠压力超负荷心肌纤维化,明确黄芩苷在AngⅡ诱导的纤维化与压力超负荷诱导的心肌纤维化中的药理作用,并深入探讨黄芩苷对心肌纤维化经典信号通路—TGF-β/Smads信号通路的调控机制。方法:(1)采用AngⅡ诱导成纤维细胞增殖,给予不同浓度黄芩苷(12.5,25和50μM)利用CCK-8法观察黄芩苷抑制成纤维细胞增殖效率;采用western blotting方法检测纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF和FN的表达。(2)给予AMPK的抑制剂Compound C,采用western blotting方法检测AMPK在黄芩苷抑制心肌纤维化中的调控作用;给予CaMKKβ的抑制剂STO-609,检测CaMKKβ在AMPK磷酸化中的调控作用。(3)给予AMPK的抑制剂Compound C,采用western blotting方法检测AMPK在TGF-β/Smads信号通路中的介导作用;western blotting与细胞免疫荧光分析Smad3的核内外表达;免疫共沉淀分别检测Smad3与P300、AMPK与P300之间的相互作用。(4)采用AAC诱导的SD大鼠心肌纤维化模型,灌胃给药不同剂量黄芩苷(12.5,25和50mg/kg),采用Masson染色的方法观察左心室横断面积胶原分布情况;western blotting方法检测黄芩苷对压力超负荷诱导的纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF与FN蛋白表达的影响;western blotting方法检测磷酸化AMPK蛋白表达;western blotting方法检测TGF-β、Smads相关蛋白表达;Western blotting方法检测Smad3核转位。结果:(1)给予AngⅡ刺激后模型组相较于正常对照组成纤维细胞增殖率显著上升(P<0.05),黄芩苷给药组较模型组明显下降,50μM黄芩苷给药组细胞增殖率进一步降低(P<0.05)。与模型组相比,各黄芩苷给药组Ⅰ型和Ⅲ型胶原与纤维化相关蛋白CTGF和FN的表达均随给药浓度的升高而下降(P<0.05)。(2)黄芩苷能时间与剂量依赖性地上调p-AMPK蛋白表达,并在AngⅡ抑制p-AMPK的表达后同样具有该作用(P<0.05)。Compound C抑制p-AMPK活性后黄芩苷抑制AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖与纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF与FN表达的作用被抑制(P<0.05)。给予STO-609抑制Ca MKKβ活性后黄芩苷激活AMPK的作用被取消(P<0.05)。(3)黄芩苷抑制AngⅡ诱导的TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白表达(P<0.05)。Compound C抑制p-AMPK活性后黄芩苷抑制AngⅡ诱导的TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白表达作用被取消(P<0.05)。AngⅡ促进了胞浆Smad3入核,并增加Smad3与转录共激活因子P300的直接相互作用,增加纤维化相关蛋白的转录激活,而黄芩苷能够抑制AngⅡ促胞浆Smad3核转位,并增加AMPK与转录共激活因子P300的直接相互作用,抑制纤维化相关蛋白的表达。(4)黄芩苷在体内抑制压力超负荷诱导的心肌胶原纤维沉积与纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF与FN表达(P<0.05)。黄芩苷在体内激活AMPK,上调p-AMPK的表达(P<0.05)。黄芩苷抑制压力超负荷诱导的TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白表达(P<0.05)。黄芩苷抑制压力超负荷诱导的Smad3核转位(P<0.05)。结论:(1)黄芩苷抑制AngⅡ诱导的原代成纤维细胞增殖及纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF和FN表达。(2)黄芩苷抑制压力超负荷诱导的SD大鼠心肌纤维化。(3)黄芩苷调控AMPK介导的TGF-β/Smads信号通路。(4)黄芩苷抑制Smad3细胞内的核转位,并抑制Smad3与P300的直接相互作用,促进AMPK与P300的直接相互作用。