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目的:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是起源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤,易转移,预后差。近年来,我国恶性黑色素瘤发病率迅速增长。多数早期患者能够通过手术得到治愈,但对于中晚期患者,标准化疗效果欠佳,因此探索高效低毒的新方法尤为重要。二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)存在于人类线粒体内膜,是一种含铁的黄素依赖酶,在嘧啶从头合成途径中起着关键的作用[1]。DHODH抑制剂影响嘧啶合成,早在1959年就被证明可以抑制肿瘤[1]。来氟米特(Leflunomide)是一种5~甲基异恶唑~4~甲酰胺衍生物,是第一个被批准用于临床治疗的DHODH抑制剂。近年来,不论是在体外细胞培养还是动物模型研究中,DHODH的失活或者下调可以明显抑制肿瘤的增殖,尤其是在黑色素瘤[2]。因此DHODH可能成为新的肿瘤治疗靶点,leflunomide有望成为新型肿瘤靶向治疗药物。但来氟米特在黑色素瘤中的作用尚无报道,因此本研究通过观察leflunomide抑制DHODH及干涉DHODH两种方法对恶性黑色素瘤细胞A375和MV3增殖、周期、死亡的影响,探索抑制DHODH对软琼脂克隆形成和荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制情况,进一步探究抑制DHODH引起肿瘤细胞增殖抑制、死亡的机制。方法:1采用台盼蓝染色计数法、MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法分析不同浓度的leflunomide(0μM、50μM、100μM、200μM)分别在24h、48h、72h、96h四个时间点对人黑色素瘤细胞增殖抑制作用,同时应用Brd U免疫荧光对leflunomide及干涉DHODH抑制A375和MV3细胞增殖情况进行分析;2应用PI单染流式细胞技术、Western Blot分析检测leflunomide及干涉DHODH对细胞周期的影响;3通过Annexin V~FITC/PI双染流式细胞分析和Hoechst 33342染色验证leflunomide是否能诱导黑色素瘤细胞凋亡;4采用Western Blot、免疫荧光和GFP~Lc3B瞬转实验验证leflunomide是否诱导A375和MV3细胞发生自噬;5通过细胞周期分析及Western Blot分析补充外源性尿嘧啶或者过表达DHODH后是否可以挽救细胞周期阻滞及自噬;6软琼脂克隆形成分析和小鼠体内成瘤实验验证leflunomide是否能抑制黑色素瘤细胞A375和MV3的成瘤能力。结果:1细胞计数和MTT结果显示leflunomide能抑制A375细胞增殖,并呈现明显的剂量依赖关系;Brd U免疫荧光染色进一步证实,与DMSO对照组相比,leflunomide处理组Brd U阳性细胞百分比显著降低;2 PI单染流式细胞分析显示:与DMSO对照组相比,leflunomide处理组细胞周期S期比例显著增加,而G0/G1期比例相应减少,通过Western Blot发现处理组周期蛋白CDK2,cyclin A2表达水平相应降低,外源性尿嘧啶可以挽救这种周期阻滞;3通过显微镜下形态学观察发现leflunomide处理组中A375细胞出现明显的凋亡形态改变,Annexin V~FITC/PI双染染流式细胞分析显示在A375细胞中leflunomide处理组出现明显的凋亡;而在MV3细胞中DMSO对照组及leflunomide处理组中都没有明显凋亡;4 Western Blot结果显示与DMSO对照组相比leflunomide可诱导A375和MV3细胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ,使细胞发生自噬。免疫荧光及GFP~Lc3B结果显示与DMSO对照组相比,leflunomide处理组可见明显点状LC3B聚集;实验组与对照组LC3B阳性细胞百分比有显著性差异,5台盼蓝染色计数和MTT结果均显示通过sh RNA技术干涉DHODH可以抑制A375和MV3细胞增殖;Brd U免疫荧光染色进一步证实,与scramble对照组相比,干涉DHODH后Brd U阳性细胞百分比显著降低;6 PI单染流式细胞技术分析显示:与scramble对照组相比,干涉DHODH后细胞周期S期比例显著增加,而G0/G1期细胞所占比例显著降低,通过Western Blot发现处理组周期蛋白CDK2,cyclin A2表达水平相应降低。外源性尿嘧啶或者过表达DHODH可以挽救这种周期阻滞;7通过显微镜下形态学观察、Hoechst 33342染色发现,PI单染流式细胞分析显示在scramble对照组或干涉DHODH组的A375和MV3细胞中均没有明显凋亡;8 Western~Blot结果显示与scramble对照组相比干涉DHODH组可诱导A375和MV3细胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ,使细胞发生自噬。免疫荧光及GFP~Lc3B结果显示实验组与对照组之间有显著性差异,与scramble对照组相比,干涉DHODH组可见明显点状LC3B聚集;9软琼脂克隆形成实验显示与DMSO对照组相比,leflunomide处理组克隆形成数显著降低;与scramble对照组相比,干涉DHODH后细胞克隆形成数显著降低。黑色素瘤细胞体内异种移植NOD/SCID小鼠模型的研究结果显示leflunomide治疗组的肿瘤体积和平均瘤重,显著低于对照组肿瘤体积和平均瘤重。结论:1本研究表明两种方法leflunomide抑制DHODH,干涉DHODH能够抑制黑色素瘤细胞增殖及克隆形成,体内实验证明DHODH抑制剂leflunomide或者干涉DHODH可以抑制细胞体外及小鼠体内成瘤能力。由此,DHODH可能是黑色素瘤细胞增殖及生存所必需的基因,DHODH可以作为一个潜在的肿瘤治疗靶点,leflunomide是一种新的很有潜力的靶向治疗黑色素瘤的候选药物。2 DHODH抑制剂leflunomide或者干涉DHODH诱导黑色素瘤细胞周期阻滞在S期。DHODH抑制剂leflunomide诱导A375发生凋亡与自噬,诱发MV3细胞自噬。干涉DHODH诱发黑色素瘤细胞自噬。说明抑制DHODH引起黑色素瘤细胞生存能力受限与诱导周期阻滞、凋亡与自噬有关。