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[目的]本研究对课题组前期分离的10株NDM-1酶阳性阴沟肠杆菌进行blaNDM-1基因环境的分析,初步从分子水平验证和解释blaNDM-1基因主要通过质粒传播的规律;选取1株阴沟肠杆菌T2进行blaNDM-1基因敲除,构建blaNDM-1基因缺失株,探讨blaNDM-1基因缺失对阴沟肠杆菌的药敏、体外生长趋势和竞争力等生物学特性的影响,为之后进一步研究blaNDM-1基因与毒力、致病力的关系以及耐药菌感染防控奠定理论基础。[方法]①运用引物步移技术对阴沟肠杆菌T1blaNDM-1基因上下游结构进行测序,并根据测序结果设计引物进行PCR mapping研究其余9株阴沟肠杆菌blaNDM-1基因上下游序列结构特点;所有测序序列通过DNAMAN Version 9软件进行拼接,使用BLAST对序列进行比对和分析,拼接结果通过软件Sequin递交到Genbank获得序列号。②应用Red同源重组技术构建阴沟肠杆菌T2blaNDM-1基因敲除株:首先,鉴于阴沟肠杆菌T2对氨苄青霉素耐药,故利用DNA克隆技术将四环素抗性基因片段插入质粒pKD46进行抗性改造;其次,聚合酶链式反应(PCR)扩增两翼与blaNDM-1基因上下游同源、中间为卡那霉素抗性的基因片段,电击转入阴沟肠杆菌T2;再次,通过阿拉伯糖诱导,含有质粒pKD46-Tet的阴沟肠杆菌T2表达Red同源重组酶,通过Red同源重组酶携有blaNDM-1基因同源臂的卡那霉素抗性片段将blaNDM-1基因置换下来,并进一步通过FLP翻转酶将卡那霉素抗性基因删除;最后,通过PCR、DNA测序和逆转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证阴沟肠杆菌T2和阴沟肠杆菌T2blaNDM-1基因敲除株。③通过VITEK-2全自动鉴定药敏系统和E-test对blaNDM-1基因敲除前后菌株进行药敏试验。④在LB液体培养基中对blaNDM-1基因敲除前后菌株进行培养,利用紫外分光光度计检测细菌光密度,连续观测24h,并绘制两者的生长曲线;将对数生长期的blaNDM-1基因敲除前后菌株1:1比例混合培养后,接种于无抗生素LB平板和含亚胺培南的LB平板上,37℃过夜培养,细菌计数获得总细菌CFU和阴沟杆菌T2的CFU,并获得竞争指数。[结果]①分析10株阴沟肠杆菌blaNDM-1基因环境,其中9株blaNDM-1基因上下游序列结构一致,blaNDM-1基因上游为部分缺失的转座酶ISAba125(AISAba/25)被ISEc33截断为两部分,下游依次为bleo、部分缺失异构酶trpF(△trpF)和ISSen4元件;另1株阴沟肠杆菌T10,blaNDM-1基因上游为△ISAba/25,下游依次为bleo、△trpF;将序列通过比对分析,递交到Genbank获得序列号为MF927777。②四环素抗性基因片段成功插入到质粒pKD46序列上,使其具有四环素抗性,命名为pKD46-Tet;PCR、RT-qPCR和DNA测序表明成功构建阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除株,blaNDM-1基因序列被删除,且无卡那霉素抗性基因,所得突变株命名为阴沟肠杆菌T2△NDM-1。③药敏试验显示阴沟肠杆菌T2与blaNDM-1基因敲除株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类和喹诺酮类呈现出相似的耐药谱,但对碳青霉烯类抗生素两者则呈现出不同的药敏结果,阴沟肠杆菌T2对亚胺培南、美罗培南和厄他培南均耐药,而blaNDM-1基因敲除株却对其均敏感。④阴沟肠杆菌T2与blaNDM-1基因敲除在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线;两者体外竞争试验的竞争指数值为0.69。[结论]①blaNDM-1基因上下游序列常包含转座酶或插入序列等元件。②运用Red同源重组技术成功敲除阴沟肠杆菌中blaNDM-1基因。③blaNDM-1基因可影响阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的药敏结果和体外竞争力,但不能对阴沟肠杆菌生长趋势与生长速度造成影响。