乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,对女性生命健康造成严重威胁。单克隆抗体类药物是目前包括乳腺癌在内的恶性肿瘤靶向治疗的重要药物。然而,传统单克隆抗体药物由于分子量大（150 k Da）,不能穿透细胞膜进而对于胞内靶标无能为力。这严重限制单抗类药物的应用范围。因而,通过合理设计,改造优化抗体分子结构,使其具有靶向胞内靶标的功能从而拓展抗体类药物的临床应用范围,已成为单抗类药物研发所面临的重要挑战。Her2和Kras是驱动乳腺肿瘤发生发展的两个重要蛋白。Her2过表达是乳腺肿瘤细胞膜重要特征之一。目前针对该靶点的单抗类药物如Herceptin、Lapatinib、Pertuzμmab等已经成为乳腺癌治疗的重要临床药物。Kras突变也在多种乳腺肿瘤中被检出并被发现是促进肿瘤进展的重要因素,目前尚未有针对Kras的靶向性药物面世。特异性抗体介导的trim-away技术可以成为成功靶向性降解突变型Kras蛋白的重要策略。据此,本研究设计了双特异性抗体策略,构建具有穿膜效果的靶向性单克隆抗体。我们将Her2纳米抗体NB2序列、细胞穿膜肽序列、Kras突变蛋白纳米抗体序列相耦联构建融合蛋白,以NB2肽段为细胞膜上选择性识别功能单元,以Kras突变型蛋白肽段为胞内突变型Kras蛋白靶向识别功能单元,以细胞穿膜肽作为引导抗体进入胞膜功能单元,以期通过三者协同作用实现对乳腺肿瘤细胞的选择性识别和靶向性干预。基于以上的设计思路,我们根据Her2纳米抗体NB2的序列构建了多个携带细胞穿膜肽的重组NB2纳米抗体融合蛋白。通过原核表达纯化,我们获取了4个耦联有不同穿膜肽的重组NB2纳米抗体融合蛋白,它们分别是GST-NB2-BP100、GST-NB2-PEVC、GST-NB2-Penetrating、GST-NB2-R9TAT2。随后我们通过流式细胞术证明了这4个重组NB2纳米抗体融合蛋白都具有与Her2细胞膜外域结合的能力。通过免疫荧光及激光共聚焦成像分析,我们发现,这4种重组NB2纳米抗体融合蛋白能够在细胞穿膜肽的介导下进入细胞膜。在Her2表达量显著差异的两种细胞株HBL100（Her2低表达）和SKBR3（Her2高表达）中进行的比较性评估发现,这4种重组NB2纳米抗体融合蛋白中,携带细胞穿膜肽PEVC的融合蛋白GST-NB2-PEVC的穿膜效率与Her2的表达量呈现显著正相关;GST-NB2-BP100与GST-NB2-R9TAT2的穿膜效率与Her2的表达量无显著相关关系;GST-NB2-Penetrating的穿膜效率与Her2表达量呈显著负相关。这表明细胞穿膜肽PEVC可以作为双特异抗体中适宜的穿膜功能单元元件。这为该双特异抗体的最后构建完成奠定了坚实的基础。