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漆酶是一种具有较高氧化还原电势的多酚氧化酶,不仅可以催化氧化酚类化合物,在某些小分子介体存在的条件下,还能够氧化非酚类物质。因此,漆酶在环境、食品性状的改良、制浆与纸浆漂白、印染与造纸工业废水的处理、生物能源领域和化工医药等诸多领域表现出良好的应用前景。本研究通过愈创木酚显色法,筛选得到一株漆酶高产菌株LS-10C,并对其进行发酵培养基优化,初步研究Trametessp.LS-10C产漆酶的补料分批发酵工艺,利用分离纯化获得的漆酶研究其基本酶学性质,以及该漆酶对偶氮染料的脱色作用,为漆酶的工业化制备和应用奠定一定的理论基础。本论文首先利用愈创木酚显色法快速从自然界中筛选得到一株漆酶高产菌株LS-10C,通过形态学观察和5.8S rDNA-ITS同源比对构建系统发育树,将其鉴定为栓菌(Trametessp.)。然后以漆酶活力为筛选指标,通过单因素实验和均匀试验设计,对Trametessp.LS-10C进行了发酵培养基优化,确定了该菌株发酵产漆酶的最优培养基配方:葡萄糖 14.4 g/L,豆渣 10.1 g/L,麸皮 100 g/L,NH4Cl 3 g/L,KH2PO4 1.4 g/L,CuSO4 · 5H20 1 g/L,NaCl 1 g/L,MgS04 0.8 g/L,CaC12 0.5 g/L,pH自然。用优化后的培养基,在30℃、200r/min、装液量为50mL/250 mL的条件下,摇瓶发酵至第8 d时酶活力达到最大值595.15 U/mL,是优化前的35.66倍。综合比较近期国内相关文献发现,Trametms sp.LS-10C具有产酶速率快、发酵时间短和酶活力高等特点。在摇瓶发酵的基础之上,初步研究了 10 L发酵罐中流加硫酸铜和葡萄糖等物料对Trametes sp.LS-10C产漆酶的影响,并获得了该菌株产漆酶的较优发酵工艺参数:硫酸铜和葡萄糖同时流加,还原糖的量控制为0.05%、发酵结束时Cu2+的量控制为3.5 mmol/L～4.0 mmol/L,搅拌转速300r/min,装液量70%,通气量5L/min,发酵温度30℃,pH自然。在上述条件下发酵至第8 d时,LS-10C漆酶活力可达到最大值868.27U/mL,约是优化前的152.11%。利用硫酸铵盐析和阴离子交换柱层析法对Trametes sp.LS-10C漆酶进行了分离纯化,获得了电泳纯漆酶,其比活力为450.55 U/mg,纯化倍数为2.36倍,回收率为58.94%。Native-PAGE和SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶分子量约65 kDa,一种同工酶。酶学性质研究表明,纯化后的LS-10C漆酶最适催化温度和pH分别为40℃和4.0,在低于50℃及pH 5.0～7.0范围内具有较好的稳定性;Cu2+和Mg2+对该漆酶活力有一定的促进作用,Fe3+、Fe2+和SDS对漆酶活力则有很强的抑制作用,抑制率分别高达 81.18%、95.70%和 93.65%;Trametes sp.LS-10C漆酶催化ABTS反应的米氏常数Km为66.97 μmol/L,最大反应速度Vm为11.35mmol/(L·min),该酶对底物ABTS有较强的亲和力。将Trametes sp.LS-10C漆酶纯化酶应用到偶氮染料脱色,采用单因素实验研究了了介体、漆酶用量、染料浓度、作用温度和pH等因素对LS-10漆酶催化直接蓝86、直接橙26和直接红31这3种直接类染料脱色的影响,结果表明:漆酶和漆酶/介体系统对不同偶氮染料的脱色效率存在较大的差异,LS-10C漆酶单独使用时对直接蓝86的脱色效率较高,而漆酶/ABTS系统对直接橙26和直接红31的脱色效率具有明显的促进作用;在给酶量为10 U/mL、染料浓度为75 mg/L～150 mg/L条件下,该漆酶对3种直接染料的脱色率较高;不同染料的最适脱色温度范围和pH具有差异性,直接橙26和直接红31的最适脱色温度范围为35℃～45℃,而直接蓝86的最适温度范围为45℃～60℃;直接红31、直接蓝86和直接橙26的最适脱色pH分别为4.0、4.5和5.0;该漆酶在最适脱色条件下催化直接蓝86、直接橙26和直接红31脱色12 h时,平均脱色率分别为70.14%、77.22%和88.36%。