背景:血管生成是大多数组织发育、维持内环境稳定和再生的关键过程,该过程受促血管生长因子浓度、时空呈现和呈现序列的调节。刺激血管生成可促进缺血性疾病的治疗,提高移植器官和组织替代物的存活率。为了将促血管生成因子转化到临床应用中,产生了无数基于生物材料的药物递送方式。许多技术都依赖于在水凝胶生物支架中加入生长因子,可以根据生长因子和支架的理化性质进行释药控制。课题组建立了一种声学响应生物支架（Acoustically-responsive scaffolds,ARSs）,基本构成是在纤维蛋白基质中加入载有生长因子的声学相变乳剂,前期已证实聚焦超声可以控制ARSs中生物活性负载的释放。目的:1.在人脐静脉内皮细胞黏附包裹的微珠和成纤维细胞共培养模型中,探讨上层培养基中不同浓度的成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）bFGF对内皮血管网生成的影响;2.在无细胞的胶中胶结构模型中,采用不同声压辐照内层声学响应支架,检测bFGF在上层培养基、外层凝胶和内层凝胶中的分布情况;3.在胶中胶结构的凝胶中,探讨不同声压和ARSs相变乳剂含量的情况下,释放bFGF对外层凝胶中血管网生长的影响;同时对比了空白乳剂对血管网生长的影响;4.聚焦超声以不同辐照模式激励ARSs对微血管网生长和成纤维细胞密度的影响。材料和方法:1.主要实验仪器:（1）超声换能器H-108产自美国Sonic Concepts公司,为已校准的单晶片聚焦超声,频率为2.5 MHz,f值为0.83,声学焦距为50 mm。该换能器由美国Ritec公司的GA-2500A型门控射频放大器推动,焦点处峰值负压（Peak rarefractional pressure,PRP）为0-8.8 MPa可调,本实验中使用该换能器辐照ARSs产生声致相变（acoustic droplet vaporization,ADV）。（2）库尔特粒度仪:Multisizer 4,美国Beckman Coulter公司生产。（3）荧光显微镜:Eclipse TiE,美国Nikon公司生产。2.主要实验试剂与材料:（1）VascuLife VEGF内皮细胞培养基,美国Lifeline Cell Technology公司生产。（2）DMEM细胞培养基,美国Gibco公司生产。（3）DMEM/F12培养基,美国Gibco公司生产。（4）载体微珠,美国Sigma公司生产。（5）牛纤维蛋白原,美国Sigma公司生产。（6）bFGF,美国EMD Millipore公司生产。（7）牛凝血酶,美国King Pharmaceuticals公司生产。（8）荆豆凝集素（Ulex europaeus agglutin I,UEA-I）,美国Vector Laboratories公司生产。（9）4′,6-二脒基-2-苯吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）,美国Thermo Fisher Scientific公司生产。（10）全氟庚烷（Perfluoroheptane,PFHep）,美国Sigma公司生产。（11）bFGF酶联免疫吸附试剂盒,美国R&D System公司生产。（12）石英微流控芯片,英国Dolomite公司生产。（13）6孔HT双向应力细胞培养板,美国Flexcell International公司生产。3.细胞株:（1）人脐静脉内皮细胞,购于美国Lonza公司;（2）正常人皮肤成纤维细胞,购于美国Lonza公司;4.实验方法:（1）不同浓度bFGF对微血管网生长的影响:（1）凝胶制备:凝胶组成包括2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10⁴个成纤维细胞/mL和50个微珠/mL,其中微珠上包裹有人脐静脉内皮细胞,每10⁴个微珠可联结4×10⁶个HUVECs,于制备凝胶前一天准备好;（2）添加培养基:配制凝胶当天,使用完全培养基。第二天,阴性对照组的上层培养基更换为饥饿培养基,其他各实验组,上层培养基更换为包含不同浓度bFGF的饥饿培养基,bFGF浓度分别为0.1 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL或100 ng/mL;（3）成像与分析:第7天或14天固定凝胶以后,分别使用荆豆凝集素和DAPI进行染色,可使用荧光显微镜及MetaMorph软件进行内皮血管网的成像及定量分析,使用ImageJ对成纤维细胞数量进行分析。（2）ADV对bFGF释放的影响:（1）乳剂制备:使用微流控芯片制作声学双相乳剂,其中W₁相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL（即0.4 U/mL）肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相为全氟庚烷（沸点82℃）;（2）凝胶制备及超声辐照:内层凝胶（0.4 mL）为ARSs,组成包括2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%（v/v）含有bFGF的双相乳剂或相应量的bFGF。外层凝胶（1.5 mL）包含2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶和DMEM培养基。待其凝聚后在凝胶上层添加完全培养基。第二天,各实验组培养基更换为饥饿培养基,并使用计算机控制的聚焦超声进行辐照（PRP为3.3或8.8 MPa）;（3）取材及检测:超声辐照前和辐照后8天连续取材,每次从上层培养基中收取0.1 mL。在第2天或第8天,采用活检针（?:6 mm）从外层凝胶中取样,并在样品中加入0.05 U纤溶酶进行消化。采用酶联免疫吸附实验来测定样品中的bFGF浓度。（3）ADV对微血管网生长的影响:（1）乳剂制备:使用微流控芯片制作水相-全氟庚烷(C₇F₁₆)微粒-微粒内水相的声学双相乳剂,其中W₁相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL（即0.4 U/mL）肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相为全氟庚烷。制作空白乳剂时,W₁相仅含有PBS;（2）凝胶制备及超声辐照:内层凝胶（0.4 mL）为ARSs,组成包括2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%（v/v）含有bFGF的双相乳剂。外层凝胶（1.5 mL）包含2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10⁴个成纤维细胞/mL和75个微珠。待其凝聚后在凝胶上层添加完全培养基。第二天,各实验组培养基更换为饥饿培养基,并使用聚焦超声、利用计算机控制进行辐照（声压为3.3或8.8MPa）;（3）成像与分析:第7天固定凝胶以后,分别使用荆豆凝集素和DAPI进行染色,对内皮血管网进行成像及定量分析。（4）ADV对微血管网生长的时间调控:（1）乳剂制备:使用微流控芯片制作声学双相乳剂,其中W₁相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL（即0.4 U/mL）肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相为全氟庚烷;（2）凝胶制备及超声辐照:内层凝胶（0.4 mL）为ARSs,组成包括2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%（v/v）含有bFGF的双相乳剂。外层凝胶（1.5 mL）包含2.5 mg/mL纤维蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10⁴个成纤维细胞/mL和75个微珠。待其凝聚后在凝胶上层添加完全培养基。第二天,各实验组培养基更换为饥饿培养基。第1天使用PRP=8.8 MPa的超声辐照ARSs的不同部分（即半个内层凝胶或整个内层凝胶）,在稍后的时间点（即第4天或第7天）用超声辐照ARSs剩余的半个胶;（3）成像与分析:第7天、第10天或第13天固定凝胶以后,对微血管网进行荧光成像及定量分析,使用ImageJ软件对成纤维细胞数量进行分析。结果:1.不同浓度bFGF对微血管网生长的促进作用:（1）微血管网总长度与bFGF浓度之间呈S型增长关系。培养14天时,50%效应时的bFGF浓度C₅₀为5.9 ng/mL[4.7,7.3],培养7天时,C₅₀为2.7 ng/mL[2.3,3.2],前者显著高于后者（P?0.05）。类似的,培养14天时血管网总长度最大值L_max为14,8008μm[7358,8710],培养7天时L_max为7,4303μm[4051,4567],前者显著高于后者（P?0.05）。（2）与最低浓度bFGF（0.1 ng/mL）相比,bFGF浓度为5 ng/mL及以上时,NHDFs密度显著性增高（P?0.05）,培养14天时,该趋势更显著。2.ADV对bFGF释放的促进作用（1）在PRP 3.3或8.8 MPa的超声辐照后,释放入上层培养基的bFGF比例显著增加（P?0.05）,无超声辐照组释放量可忽略不计（即?0.02%）。在同样的乳剂浓度情况下,bFGF释放量与声压相关,在PRP 8.8 MPa辐照时,含1%乳剂的ARSs比0.25%组释放出更多的bFGF（P?0.05）;当PRP 3.3 MPa辐照时,二者则无显著性差异（P>0.05）;（2）bFGF直接存在于内层凝胶中时,对于含有167 ng和668 ng bFGF的凝胶,bFGF释放最大百分比C_max分别为23.5%[22.4,24.7]和22.1%[21.2,23.1]（P?0.05）,速率常数K分别为1.1天^-1[0.8,1.6]和0.9天^-1[0.7,1.2]（P?0.05）;（3）通过检测bFGF在系统中的分布可知,大部分添加的bFGF仍存留于内层凝胶中,同时,比较第2天与第8天结果时,发现所有组内层凝胶或培养基中的bFGF均有所增长。3.ADV对微血管网生长的促进作用:（1）载有bFGF的全氟庚烷乳剂微粒粒径测量结果:乳剂平均值为6.2±0.13μm,变异系数为13.4%±0.6%;（2）空白乳剂对血管生成的影响:对于空白乳剂,在没有bFGF递送的情况下,ARSs中ADV的发生对血管网生长有显著的促进作用（P?0.05）,但作用有限。其中完全培养基中生长的微血管网长度（4235±1816μm）比饥饿培养基中的（258±77μm）高16倍（P?0.05）;（3）ADV促进微血管网生长:与饥饿培养基条件相比,无超声辐照组和PRP 3.3 MPa辐照0.25%（v/v）乳剂组的微血管网无显著增加（P>0.05）,而PRP 3.3 MPa辐照1%（v/v）乳剂组、PRP 8.8 MPa辐照0.25%（v/v）乳剂组和PRP 8.8 MPa辐照1%（v/v）乳剂组微血管网长度均显著增加（P?0.05）。总而言之,微血管网生长与ARSs中载有bFGF乳剂的含量和用于释放bFGF的声压有关。4.ADV时间调控bFGF的释放对微血管网生长的影响（1）在特定条件下,培养时间越长,血管网总长度越长。所有超声辐照组血管网均显著长于无超声辐照组。然而,在相同的培养时间下,不同的辐照方式间（即全部一次性辐照或分批辐照）无显著性差异（P?0.05）。NHDFs亦观察到类似的趋势（P?0.05）;（2）通过对微血管网总长度和微珠离ARS距离基于斜率的分析,显示二者无相关性（P?0.05）。结论:1.微血管网长度与上层培养基中bFGF的浓度呈S型相关,且成纤维细胞密度也随着bFGF浓度增加而增大。2.将bFGF直接添加入纤维蛋白的内层凝胶时,可观察到突释现象。ARS中含有等量的乳剂时,bFGF释放量与辐照声压相关,即声压越大,bFGF释放入上层培养基的量越大。采用高声压辐照时,bFGF释放入培养基中的速率与ARS中乳剂含量呈反比,这可能是由于气泡形成使bFGF的扩散路径更长。3.乳剂中含有bFGF时,ARS中气泡的形成、外层凝胶中的血管网生长与ARS中载有bFGF乳剂的含量和用于产生ADV的声压有关。空白乳剂对内皮血管网的生长也有轻微的促进作用。4.聚焦超声在不同时间点或辐照不同范围的ARS,使其释放出不同剂量的bFGF,结果显示该方式对血管网生长无明显影响。结合剂量依赖曲线,原因可能是给药量不足。