甾体微生物转化是甾体药物工业生产的关键技术之一,尤其是利用丝状真菌在甾体母核的特定位点引入羟基制备大部分皮质激素药物的关键中间体。但目前工业上用于甾体羟基化的真菌菌种还存在转化效率不高和副产物多等问题。近期课题组从丝状真菌菌种中克隆鉴定了多个甾体羟化酶基因,但由于生产菌种的基因操作体系不成熟,因此难以在短期内对其进行定向遗传改造。为了充分利用已有的基因资源,有必要研究开发高效的甾体羟化酶基因异源表达系统。鉴于脉孢菌具有营养要求简单,生长快,遗传背景清楚,遗传工具丰富,分子遗传操作容易,同时也是模式丝状真菌等特点,本论文主要研究将脉孢菌作为真菌甾体羟化酶基因异源表达宿主的可行性。脉孢菌具有非特异性地转化4-AD、沃氏氧化物、双酮等甾体底物的P450酶系,因此鉴定和删除相关转化基因是构建脉孢菌表达宿主的前提。论文首先确定了脉孢菌甾体转化主要活性依赖甾体底物诱导,随后利用RT-PCR扩增,考察了脉孢菌42个P450基因受甾体底物的诱导表达情况,结果表明其中4个基因受甾体底物的高度诱导。分别构建表达的29个候选基因的重组酿酒酵母,转化实验显示基因NCU05001酿酒酵母重组菌株具有对甾体底物具有一定的转化活性。构建了基因NCU05001的毕赤酵母重组菌株,进一步确定转化活性的存在。HPLC分析表明重组菌对沃氏及4-AD的转化产物与脉孢菌对沃氏及4-AD的有相同转化产物,说明NCU05001基因编码的P450酶在脉孢菌对沃氏甾体底物的转化中起主要作用。NCU05001基因的克隆鉴定将为构建真菌甾体羟化酶的表达宿主奠定了基础。