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蚜虫是一类造成作物和观赏植物经济损失的重要害虫,除虫菊(Tanacetum cinerarifolium)作为天然抗虫植物一直备受关注。对于除虫菊抗虫机理的研究多是集中在体内不挥发的除虫菊酯,而基于挥发性物质的抗虫机理尚不明确。对除虫菊的田间观测发现,没有蚜虫危害的除虫菊上常停留有大量的瓢虫,进一步检测除虫菊次生代谢挥发物,一种类似蚜虫报警素的E-β-法尼烯(EβF)是峰值最高的物质。本课题组前期的昆虫行为实验证实了除虫菊花苞期释放的EβF是植物吸引瓢虫、趋避蚜虫的关键因素,除虫菊EβF的释放与植物的生长发育阶段和机械损伤密切相关。为揭示除虫菊EβF合成部位及释放规律,本课题通过克隆EββFS基因启动子,构建融合GUS报告基因的表达载体,转化烟草,通过GUS组织化学染色分析EβFS基因启动子的组织表达特性,通过测定GUS酶活性分析不同处理(机械损伤、蚜虫取食损伤、茉莉酸甲酯)下EβFS基因启动子的诱导表达特性,深入探讨EβFS基因启动子的功能,从而为研究除虫菊基于挥发性物质的抗虫机理奠定基础。本课题的主要研究结果如下:1.除虫菊EβFS基因gDNA全长的克隆克隆除虫菊EβFS基因gDNA片段共2220bp,该基因组序列含有6个内含子,7个外显子。2.高保真酶扩增EβFS基因启动子及其顺式作用元件分析克隆EβFS基因启动子共2245bp。该启动子含有响应茉莉酸甲酯的CGTCA-motif元件,响应生长素的TGA-element元件,响应水杨酸的TCA-element元件,响应赤霉素的MYBGAHV元件;响应损伤的WBOXNTERF3元件等。3.EβFS基因启动子融合GUS报告基因的载体构建及proEβFS::GUS表达载体转化烟草构建pBI121-proEβFS::GUS融合载体,将proEβFS:GUS表达载体电转化农杆菌GV3101,叶盘法转化烟草,得到30个独立株系,其中24株转基因烟草为阳性。4.EβF 基因启动子的组织表达特性分析将转基因烟草不同部位分别进行GUS化学组织染色,蓝色部位仅在叶柄和茎的韧皮部,该结果验证EβFS基因启动子在植株叶柄和茎韧皮部特异性表达。5.EβFS基因启动子的诱导表达特性分析机械损伤:机械损伤会导致GUS酶活性在30min最高,随着损伤时间的延长GUS酶活性降低,并且机械损伤会导致邻近未损伤叶片的GUS酶活性提高。该结果验证了EβF 基因启动子能够响应机械损伤的诱导,而且1h之后迅速恢复。茉莉酸甲酯:与未处理的烟草(0h)相比,喷施MeJA后,转基因烟草的GUS酶活性显著提高。随着喷施时间的增长,GUS酶活性表现出先升高后降低的趋势,在处理6h后GUS酶活性最高。该结果验证了EβFS基因启动子能够响应茉莉酸甲酯的诱导。蚜虫取食:与未处理的烟草(0h)相比,接种蚜虫后,随着接种时间的延长,GUS酶活性表现出先升高后降低的趋势,在处理48h后GUS酶活性最高,但是响应不显著。该结果表明蚜虫取食在一定程度上诱导EβFS基因启动子表达。