家蚕味觉受体的RNA干扰条件摸索及BmGr63相关功能初探

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植食性昆虫在长期的进化过程中与寄主植物形成了特定的相互作用模式。昆虫利用化学感受系统对外界环境信息进行综合处理进而对趋性反应、觅食、取食行为进行指导。目前开展的比较多的是对昆虫嗅觉受体的研究,对于昆虫味觉受体的研究相对较少。昆虫的味觉受体参与到昆虫的多项生理活动,例如在昆虫的取食行为中起着至关重要的作用。位于昆虫味觉神经元中的味觉受体可以识别植物汁液中的可溶性化学成分,再通过味觉受体神经将这些信息传入到中枢神经中,中枢神经将传入的信息进行整合进而决定是否取食该植物。目前对于这种分子识别机制的研究尚未透彻,家蚕(Bombyx mori)作为一种重要的经济昆虫,经过长期的人工驯化历程,它已与桑树形成了独特的互作关系。对家蚕味觉受体配体的鉴定与分析能够为寡食性的鳞翅目昆虫与其寄主植物间的关系提供一定见解,为深入了解动物-植物协同进化打下基础。本研究以家蚕幼虫为实验材料,采用分子生物学、钙离子成像等方法,通过RNAi技术对家蚕的味觉受体表达模式进行研究,主要研究结果如下:1、家蚕味觉受体BmGr63的克隆及表达根据家蚕味觉受体在家蚕幼虫各部位的表达图谱,发现该家蚕味觉受体相对于其他味觉受体在取食旺盛期的取食相关器官中有较高的表达量。本研究从家蚕幼虫的下颚c DNA中成功克隆得到了BmGr63,通过蛋白结构预测网站HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html)预测该基因蛋白序列跨膜结构,结果表明其蛋白结构具有典型的7个跨膜结构域,符合味觉受体的结构特征。进行荧光定量PCR发现BmGr63在家蚕幼虫的上唇、上颚、下唇、下颚、胸足以及中肠中均有表达,对BmGr63和几个已鉴定配体物质的昆虫味觉受体进行氨基酸序列比对分析,结果显示BmGr63与Harm Gr1亲缘关系相对较近,而Harm Gr1被证明是识别海藻糖的受体,因此推测BmGr63也是相关糖受体。通过钙离子成像技术对BmGr63的配体物质进行了初步的鉴定,筛选了四种糖类物质蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖,结果表明这四种糖类物质均不是BmGr63的配体物质。2、dsRNA介导的BmGr63表达量下调以BmGr63为研究对象,使用细菌诱导表达dsRNA和T7体外转录合成dsRNA两种方法均成功合成BmGr63特异的dsRNA,使用增强绿色荧光蛋白基因EGFP特异的dsRNA作为对照。利用饲喂和注射的方法将dsRNA导入家蚕幼虫体内对该基因进行干涉表达。五龄幼虫在连续添加3次1μg,3μg,5μg剂量的dsRNA63后,结果表明在饲喂后12 h、24 h、36 h时BmGr63的相对表达量都低于正常的幼虫。并且发现添加剂量为5μg,作用时间为24 h时,干扰效率达到最大为34.19%。进一步探究添食dsRNA对味觉受体表达量的影响,添加1次5μg,10μg剂量的dsRNA后,结果表明在饲喂后的12 h、24 h、36 h后BmGr63的相对表达量都低于正常的幼虫,并且发现添加剂量为5μg,作用时间为12 h时,干扰效率达到最大为54.45%。对四龄眠起的家蚕每隔12 h添加剂量为5μg的dsRNA并观察出现的表型,结果显示干扰BmGr63没有对家蚕幼虫的体重以及产卵量造成明显的影响,但发现了两头翅原基发育不完全的蚕蛹,可能与相关激素识别受抑制相关。下一步可通过基因编辑技术对这一功能进行深入的研究。
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