背景钙化性主动脉瓣膜狭窄(Calcific aortic valve stenosis,CAVS)的发病率位居心血管疾病中的第三位,表现为主动脉瓣的纤维化、钙化以及瓣叶交界处的融合,从而造成瓣口面积的狭窄。由于其具体的发病机制尚未明了,目前只能通过置换人工瓣膜的方式进行治疗。基础研究的进展提示,主动脉瓣钙化不仅是一个细胞萎缩凋亡导致钙盐被动沉积的过程,还涉及瓣膜间质细胞向成纤维母细胞和类成骨细胞的转分化。瓣膜间质细胞是维持主动脉瓣正常形态和生理功能的主要执行者,其体外钙化模型作为一种有效工具被广泛应用于CAVS的机制和药物研究中。氧化应激(Oxidative stress)是氧化还原系统失衡后活性氧簇(ROS)在细胞内堆积并造成组织损伤的过程。近年研究发现,ROS水平在钙化的主动脉瓣中升高,与抗氧化酶的减少有关,并能引起瓣膜间质细胞的DNA损伤和早期活化。越来越多的证据表明氧化应激/ROS与细胞自噬之间存在着紧密而复杂的联系。自噬(Autophagy)是一种对细胞成份进行自我消化并实现再循环利用的现象,在生物体内广泛存在且在进化中高度保守,是近十年来基础医学研究的一大热点。ROS被认为能对自噬进行正向或负向的调节,而自噬也能通过降解氧化还原相关的蛋白和细胞器影响ROS。然而,自噬现象并没有在CAVS中得到深入、可靠的研究,而氧化应激与自噬的关系在主动脉瓣钙化领域中还未见报道。目的(一)观察自噬现象对钙化性主动脉瓣狭窄及瓣膜间质细胞体外钙化过程中发生的情况。(二)明确自噬对主动脉瓣钙化及其中伴随的细胞损伤/凋亡的影响和具体机制。(三)探索氧化应激与自噬在主动脉瓣钙化过程中的相互作用及具体机制。方法(一)瓣膜标本及细胞培养1、临床标本的收集与处理:收集在我科行瓣膜手术的CAVS患者的钙化性主动脉瓣标本以及纤维化增厚的主动脉瓣,以尸检或心脏移植患者的瓣膜为正常对照组,将组织标本迅速固定于福尔马林或冻存于液氮中以待检测。2、猪来源主动脉瓣膜间质细胞(PAVICs)的分离:将猪主动脉瓣切除后,置于Ⅰ型胶原酶中37℃消化10分钟,使用灭菌棉签将表面的而瓣膜内皮细胞擦除,再置于Ⅱ型胶原酶中37℃震荡消化2小时,过滤、离心后重悬。3、PAVICs的鉴定:使用免疫荧光法对PAVICs进行间质细胞标记物Vimentin、成纤维细胞标记物α-SMA、内皮细胞标记物CD31的检测。4、PAVICs的培养:使用含双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基,置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中进行培养,实验使用3-6代细胞,每2-4天换液。(二)体外成骨诱导及钙化相关的检测1、体外钙化模型的建立:使用配方分别为2m M磷酸二氢钠、50μg/ml抗坏血酸、107M胰岛素和10m Mβ-磷酸甘油钠、50μg/ml抗坏血酸、100n M地塞米松的两种钙化培养基(OIM-1/2)诱导PAVICs成骨,发生钙盐沉积所需的培养时间分别为7天和21天。2、瓣膜间质细胞向类骨母细胞转分化的检测:通过免疫印迹法检测α-SMA和成骨标志物RUNX2、OPN的表达;使用BCIP/NBT碱性磷酸酶染色法检测ALP的表达。3、钙盐沉积的检测:配制p H=4.3的1%茜素红S染色液对钙结节进行染色。(三)自噬的检测及干预方法1、形态学检测:使用透射电子显微镜对瓣膜组织标本中自噬体、自噬溶酶体等自噬相关结构进行直接观察。2、组织中自噬水平的分析:通过免疫组织化学、免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7的表达水平;使用免疫荧光双标检测BECN1与Vimentin的共定位。3、PAVICs中自噬体的形成及相关通路的检测:配合巴伐洛霉素A1,通过免疫印迹法检测LC3-Ⅱ/Ⅰ的转化比、自噬相关蛋白、p-AKT(ser473)和p-P70S6K(Thr389)的表达。4、PAVICs中自噬流的发生:免疫印迹法检测P62的降解;GFP-m RFP-LC3双荧光示踪系统检测检测自噬体的形成以及自噬体和溶酶体的结合。5、自噬的干预:使用雷帕霉素增强自噬;渥曼青霉素和氯喹抑制自噬;构建自噬关键基因BECN1的干扰腺病毒,特异性地抑制自噬。(四)氧化应激的诱导、干预及细胞损伤相关的检测1、氧化应激模型的构建:使用含100~1000μM过氧化氢的完全培养基刺激PAVICs 0.5小时~14天。2、活性氧水平的检测:使用2’,7’-DCFH绿色荧光探针标记活性氧,通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量分析。3、氧化应激的干预:应用N-乙酰半胱氨酸清除PAVICs内的活性氧。4、细胞毒性分析:使用CCK-8法测定细胞的活性;使用乳酸脱氢酶释放实验检测细胞膜的损伤。5、细胞凋亡的干预和检测:应用Caspase通路抑制剂Z-Vad-FMK抑制细胞凋亡;使用Annexin V/PI双标记PAVICs,并通过流式细胞术定量分析早/晚期凋亡的比例;通过免疫印迹法检测Caspase3、PARP的剪切体/前体比例反应细胞凋亡中Caspase途径激活的程度。结果(一)钙化性主动脉瓣狭窄中自噬水平的检测。在透射电镜下可以观察到纤维化主动脉瓣中有较多的自噬体,钙化的主动脉瓣细胞中存在大量的自噬体和自噬溶酶体,而正常的瓣膜中只能找到少量的自噬前体。免疫组织化学结果显示自噬相关蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7在纤维化和钙化的瓣膜中的阳性表达高于正常瓣膜;免疫印迹半定量分析提示在CAVS标本中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例显著升高,BECN1和ATG5都有不同程度的高表达,而ATG7在三组之中未见明显差异。免疫荧光双标记的结果表明自噬关键基因BECN1在Vimentin阳性的瓣膜间质细胞中出现了强阳性,证明在纤维化、钙化的主动脉瓣中,瓣膜间质细胞的自噬水平升高。(二)主动脉瓣膜间质细胞体外钙化模型中自噬的水平及功能研究。经免疫荧光鉴定后,使用改良的胶原酶两步消化法分离的猪来源主动脉瓣膜间质细胞(PAVICs)未受内皮细胞的污染。在两种钙化培养基(OIM-1/2)培养PAVICs的过程中,OPN和RUNX2表达明显升高,α-SMA降低,ALP染色阳性,提示PAVICs由成纤维细胞转分化为类骨母细胞;茜素红染色显示OIM-1/2都能使体外培养的PAVICs出现大量的钙盐沉积。使用OIM-1/2短期(<24小时)刺激PAVICs后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加,P62减少,巴伐洛霉素进行干预后OIM-1/2中PAVICs的LC3-Ⅱ相对于对照组仍然增加,提示了自噬的发生;通过GFP-m RFP-LC3示踪系统也直观的观察到了自噬体和溶酶体的结合;而在OIM-1/2长期(4~21天)的培养过程中,BECN1、ATG5、ATG7的表达均有不同程度的升高。当使用自噬药物对体外钙化模型进行干预时,诱导剂雷帕霉素能够显著地缓解钙盐沉积,而抑制剂渥曼青霉素和BECN1干扰腺病毒加重了钙化程度;免疫印迹分析显示雷帕霉素干预后,PAVICs在OIM-1/2中OPN、RUNX2表达减少,α-SMA表达水平恢复,ALP染色阳性强度减弱,而渥曼青霉素和sh BENC1的作用与之相反,提示自噬能够通过延迟PAVICs向类骨母细胞转分化以缓解主动脉瓣钙化的发生。另外,在钙化培养基诱导的中途应用雷帕霉素也能减轻最终的钙化。(三)自噬在主动脉瓣膜间质细胞氧化应激模型中的水平和作用。2’,7’-DCFH-DA探针标记和免疫印迹结果分别显示体外钙化模型中PAVICs内的活性氧水平升高并发生了Caspase途径依赖的凋亡,使用N-乙酰半胱氨酸清除ROS后行流式检测发现钙化培养基中PAVICs的凋亡减少,而N-乙酰半胱氨酸(NAC)和凋亡抑制剂Z-Vad-FMK都能够明显抑制PAVICs的钙化程度,揭示了氧化应激及其引发的细胞凋亡是主动脉瓣钙化的重要机制。通过对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及P62的检测发现自噬在PAVICs氧化应激模型中的发生呈浓度依赖式,而NAC能抑制自噬的发生。不同时间点(0.5~12小时)的检测提示过氧化氢诱导PAVICs时通过PI3K-AKT-m TOR通路激活自噬。结合巴伐洛霉素A1的干预和GFP-m RFP-LC3示踪系统,可以观察到氧化应激模型中自噬体的形成和完整自噬流的发生。NAC在体外钙化模型中也能抑制自噬,提示主动脉瓣钙化过程中的自噬现象至少部分由氧化应激引起。在长期的氧化应激模型中,BECN1、ATG5、ATG7在第7天时表达升高,而在14天时表达减少。细胞活性检测结果显示Z-Vad-FMK能显著提高PAVICs在250~750μM过氧化氢下的存活率,提示凋亡是细胞在氧化应激模型中发生死亡的主要方式。CCK8和LDH细胞损伤检测显示,使用自噬药物进行干预后,雷帕霉素能在不同时间点、不同过氧化氢浓度下提高细胞活性、降低细胞的损伤,而渥曼青霉素和氯喹会加重其损伤和死亡。随后的凋亡检测也得出一致的结果,增强自噬能够显著缓解PAVICs的细胞凋亡和Caspase途径的激活,而抑制自噬后有着相反的影响。最后通过流式细胞术对2’,7’-DCFH-DA标记的各处理组进行定量分析后发现,自噬是通过清除细胞内过度堆积的活性氧而发挥其对PAVICs的保护作用的。结论氧化应激在主动脉瓣钙化的过程引起了瓣膜间质细胞高水平的自噬现象,自噬不仅能通过清除过量的ROS减轻氧化应激介导的瓣膜间质细胞损伤/凋亡,还能在体外钙化模型中抑制瓣膜间质细胞向类骨母细胞转分化从而缓解其钙化程度。