近几年来,抗体药物是市场上生物药物的主要品种之一,全球销量最佳的生物药物中抗体药物占据很大比例。几乎所有抗体药物的表达系统都是基于哺乳动物细胞表达系统,这是因为哺乳动物细胞的表达产物与天然分子相近,例如翻译后的糖基化修饰。但同时,哺乳动物细胞表达系统培养成本高、周期长,使其已严重阻碍了抗体药物的发展。相比而言,毕赤酵母作为一种真核生物,具有繁殖速度快,产量高,培养成本低等优势,可以用于各种重组蛋白的表达和分泌。而经过糖基工程改造之后的酵母细胞,其蛋白质的糖基化修饰接近哺乳动物细胞的复杂型糖型,而不再是一般酵母的高甘露糖型,与天然分子更加相似。糖基工程酵母的蛋白表达的糖基化修饰与真核细胞十分相似,且相比于哺乳动物细胞成本更低,产量更高,糖基工程酵母有望成为包括抗体在内的糖蛋白药物的制备的新途径。抗体库技术是目前发现特异性抗体的重要手段之一,基于该技术筛选抗体高效而快捷,能够同时进行不同抗原靶位的筛选,成为寻找、制备、研发新的单抗药物的重要方式。从构建方式上可将抗体库分为哺乳动物细胞抗体库、噬菌体抗体库和酵母抗体库等。其中噬菌体抗体库因其构建方法简单,库容量大等优点是目前所用最多的抗体库,但噬菌体抗体库表达多为单链抗体,现如今绝大多数通过抗体库筛选得到的抗体,其结构都不是抗体的天然构象,多为单链抗体,因此需要在筛选之后重新进行完整抗体的构建和表达,步骤较为复杂。本研究使用锚定蛋白Sed,构建糖基工程酵母表面呈现抗体库。使用Sed锚定蛋白在实现半抗体在酵母细胞表面展示的同时,还具备分泌完整结构单克隆抗体的能力,即与锚定蛋白串联表达的Fc段,可以与分泌抗体的Fc结合通过二硫键聚合,将抗体结构的一半即半抗体锚定在酵母细胞表面,锚定在细胞上的半抗体既可以保持最初的生物活性,也可以保持原有的结构,不因定位在细胞表面而使空间结构发生改变,利用这种双重模式,在保留抗体完整结构的情况下,达到筛选和表达分泌的统一。本研究利用糖基工程酵母构建表面呈现免疫抗体库,具体步骤如下:抗禽流感血凝素(HA7)抗体质粒库的构建:禽流感血凝素HA7作为抗原对小鼠进行免疫,在三次免疫之后提取小鼠脾脏细胞,对小鼠脾脏进行研磨,提取RNA,用反转录试剂盒扩增小鼠脾脏细胞的轻重链可变区基因,和人源Ig G的恒定区基因同框融合构建抗HA7的抗体质粒库,获得约104的单克隆,随机挑选10个单克隆测序,对比序列结果发现随机挑选的10个单克隆序列均具有抗体骨架结构,同时可变区序列各不相同,说明质粒库的基因多态性良好。糖基工程酵母表面呈现的免疫抗体库的构建:将锚定蛋白与抗体Fc段(Fc-Sed)融合表达载体电转化糖基工程酵母细胞,阳性转化克隆培养诱导后,用抗Ig G-Fc抗体流式细胞检测、筛选,获得在糖基工程酵母表面锚定表达Fc-Sed融合蛋白的酵母细胞。将构建好的质粒库电转化表达了Fc-Sed融合蛋白的糖基工程酵母细胞,构建表面抗体库。免疫磁珠法筛选抗体库:因为免疫磁珠筛选方法简单、快捷,本研究采用免疫磁珠的筛选方式。先用空羧基磁珠通过缩合反应将HA7蛋白结合在磁珠表面,之后将该磁珠加入到酵母表面呈现抗体库中进行筛选。为了得到与HA7特异性结合的抗体,对抗体库进行两轮筛选。将两轮筛选菌液稀释铺板,分离单克隆。ELISA方法检测抗体与HA7蛋白结合能力:随机挑选30个单克隆培养、诱导,培养上清采用ELISA双抗夹心法鉴定抗体与HA7的结合能力。其中与HA7结合能力最强的抗体的稀释倍数为1:200,而其他单克隆的表达上清最高为1:50,挑选滴度最高的单克隆摇瓶培养,protein A纯化后用于进一步的实验,将该抗体命名为N2-2抗体。N2-2抗体结合HA7蛋白的靶位分析:Western进一步验证了N2-2抗体与HA7的结合情况,但N-糖肽酶PNGase F切除HA7的糖基后发现N2-2抗体不再与HA7蛋白结合,提示N2-2抗体的识别位点位于HA7的糖链。进一步研究发现,N2-2抗体与α-甘露糖基修饰的牛核糖核酸酶B,杂合型糖基修饰的昆虫细胞表达的HA7,以及复杂型糖基修饰的鸡胚来源的流感疫苗均不结合,而与酵母、白色念珠菌裂解物有明显的结合,提示其可能作用于真菌特有的糖基,如β-甘露糖,磷酸甘露糖等。Western分析发现,敲除β-甘露糖转移酶ARM1的糖基工程酵母表达的HA7不与N2-2抗体结合,提示抗体可能结合在β-甘露糖上,再利用β-甘露糖苷酶切除HA7的末端甘露糖,Western印迹结果发现酶切之前66Kb的位置有条带而酶切之后条带消失,说明酶切之后的HA7蛋白不再与N2-2抗体有结合,最终确证N2-2抗体确实是与HA7糖链上的β-甘露糖结合。N2-2抗体在小鼠体内的活性分析:β-甘露糖是真菌特有的糖型,因此,本研究以白色念珠菌为模型,研究N2-2的抗真菌活性。首先Western证实白色念珠菌裂解物可以与N2-2抗体结合,然后以Bal B/C小鼠作为实验动物,首先将白色念珠菌的活菌用生理盐水进行稀释,配置成浓度为1×107个/m L、4×107个/m L、1.6×108个/m L和6.4×108个/m L的菌液,将配置好的菌液通过腹腔注射。观察小鼠的体重变化,确定感染后小鼠体重下降明显的最佳剂量是4×107个/m L。将白色念珠菌的菌液配置成4×107个/m L,将Bal B/C小鼠分成4个组,分别是生理盐水组,白色念珠菌组,白色念珠菌+30μg N2-2抗体组和白色念珠菌+15μg N2-2抗体组,其中,两抗体注射组抗体与白色念珠菌注射液预混合1h之后腹腔注射小鼠。实验结果发现,注射了抗体的小鼠体重相比未注射抗体的小鼠,体重回升早,而且回升速度快;而不同剂量的N2-2抗体对小鼠体重的恢复也有影响,高剂量组的小鼠体重回升速度更快,恢复时间更早,说明N2-2抗体在小鼠体内具有一定的抗白色念珠菌活性,且抗菌活性随抗体用量增加而增加。本研究基于糖基工程酵母表面呈现免疫抗体库,筛选抗体库得到特异性针对β-甘露糖的抗体,进一步实验证明该抗体在小鼠体内具有抗白色念珠菌活性活性。为抗真菌抗体的研究提供了基础。同时,建立的糖基工程酵母表面呈现抗体库技术也可以为其他抗体的筛选提供参考。