论文部分内容阅读
第一部分 MKP-1通过抑制MAPK/ERK通路改善AD小鼠突触和认知功能研究 目的:丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)对MAPK信号通路具有显著的抑制作用,而MAPK在AD发生中参与了Aβ的沉积,tau的过度磷酸化,神经元的凋亡等过程。然而,MKP-1是否通过抑制 MAPK信号通路在AD发病中发挥重要的作用,尚不清楚。因此,本研究旨在探索MKP-1在AD病理发生发展过程中的作用及相关的分子机制。 方法:在6月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠侧脑室定位注射MKP-1过表达及干扰病毒 1.行为学测试:6个月后(12月龄)采用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆功能; 2. Western blotting:完成行为学实验后,取海马组织,通过Western blotting检测MKP-1的表达,APP及其剪切产物C89和C99,以及APP代谢相关的分泌酶BACE1和PS1等; 3.实时荧光定量PCR:Q-PCR检测APP和BACE1以及MKP-1的mRNA水平。 4. ELISA检测Aβ40和Aβ42的生成; 5.透射电镜:戊二醛灌流固定后,电镜检测海马CA1区突触结构; 6.离体电生理:膜片钳记录检测海马CA1区LTP改变; 7.荧光素酶报告基因:荧光素酶检测 MKP-1对 APP和 BACE1启动子活性的影响; 结果:与WT相比,AD小鼠海马内的MKP-1无论在mRNA水平还是在蛋白水平,表达均显著降低。通过侧脑室定位注射AAV过表达MKP-1,改善了 AD小鼠的学习和记忆以及海马 LTP。透射电镜提示MKP-1过表达显著增加 AD小鼠海马区域的突触数量。荧光素酶和Western显示MKP-1过表达可以通过抑制APP和BACE1启动子的活性,从而减少APP和BACE1的表达,而这个减少主要是通过MKP-1抑制MAPK/ERK通路发挥作用。 结论:本研究发现MKP-1随着AD的进程,表达逐渐降低,通过AAV过表达MKP-1可以明显改善AD小鼠的认知功能、海马突触结构及可塑性。同时发现MKP-1通过降低APP和BACE1启动子活性,减少其mRNA表达,进而减少老年斑的形成。这一研究表明,MKP-1可能通过抑制MAPK/ERK信号通路改善AD小鼠的突触和认知功能,从而为临床治疗AD提供新的靶点。 第二部分人参皂苷Rf对Aβ诱导细胞毒性保护作用研究 目的:人参作为中国传统药材已有2000多年历史,而人参皂苷Rf则是一种人参提取物,主要发挥抗炎功能,炎症是AD主要原因之一,那么Rf是否能通过抗炎而减缓AD的发病过程即本实验目的所在。 方法:用Rf处理N2A-APP细胞以及Aβ诱导过的N2A细胞 1. Western blotting:细胞裂解液用来检测Rf对Aβ引起的炎症以及细胞凋亡相关因子caspase-1和caspase-3,以及APP产生Aβ的相关分泌酶,APP、BACE1及PS1的表达变化; 2. ELISA:检测Aβ40和Aβ42的生成; 3.流式:流式检测细胞内Ca2+,线粒体膜电位以及活性氧ROS; 4.Q-PCR:实时荧光定量检测炎症相关因子IFN-γ和IL-13 mRNA。 结果:与正常细胞相比,Aβ处理细胞后细胞凋亡和炎症显著增加,而Rf可以显著减少Aβ引起的细胞凋亡,如细胞内Ca2+的浓度以及活性氧ROS,线粒体膜电位MMP和磷酸化caspase-3显著降低;同时Rf可以减轻Aβ引起的炎症反应,如活化的caspase-1及IFN-γ显著增加而IL-13显著降低;Rf还可以通过增加Aβ的降解从而减少Aβ的含量。 结论:以上研究表明,Rf通过减轻Aβ引起的炎症和细胞凋亡从而起到神经保护的作用,为AD的防治提供了新的药物靶点。