流感病毒是流行性感冒的病原体,根据其核蛋白与基质蛋白抗原性的不同分为甲,乙,丙三型。A型流感病毒(Influenza A virus)属正粘病毒科,由8个节段组成的单股负义RNA链,共编码10种多肽,其中由第5节段的RNA编码的核蛋白(Nucleoprotein, NP)高度保守,具有种群和型的特异性,是流感病毒分型和诊断的基础。因此,在原核或真核表达系统中表达NP蛋白,可用于A型流感酶免检测方法的探索,为A型流感病毒的临床诊断提供及时准确的参考信息。本研究采用合成的A型流感病毒(A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1))NP DNA基因作为模板,PCR法扩增得NP基因全长为1498bp,编码498个氨基酸,构建重组质粒并转化表达载体,所表达的A型流感NP蛋白相对分子质量为57 KD左右；将流感NP蛋白免疫动物制备两种抗血清,纯化抗血清中的抗体用作A型流感酶免检测中的包被和标记抗体,最终用于A型流感双抗体夹心检测方法初步探索。本文研究的主要内容：(1)本研究利用人工合成A型流感病毒株H5N1 NP DNA基因序列作为模板,构建原核重组质粒pET-30 Xa/LIC-NP,并诱导该原核重组质粒在大肠杆菌表达系统中表达、纯化A型流感NP蛋白；(2)用纯化后的NP蛋白免疫羊、兔,收取羊抗NP血清、兔抗NP血清,纯化并用HRP标记羊抗NP多抗和兔抗NP多抗；(3)A型流感双抗体夹心检测方法(酶联免疫法)初步探索,使用所制备的多克隆抗体均可作为双抗体夹心中的包被及酶标抗体,对A型流感双抗体夹心检测方法进行可行性分析。本研究采用原核表达系统表达并纯化A型流感NP蛋白,消除了采用天然抗原的生物安全性隐患,是A型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步探索,为开发流感早期诊断试剂盒提供支持。