狂犬病是人们熟知的一种传染性疾病。狂犬病是由狂犬病毒引起的,一旦人类和动物发病,几乎100%导致其死亡。暴露后预防(PEP)是控制其发病的最好方法。暴露后预防包含三个步骤:清洗伤口、接种疫苗和浸润注射免疫球蛋白。由于现有的免疫球蛋白为马源免疫血清(ERIG)和人源免疫血清(HBIG)。ERIG的副反应非常大,且HRIG存在潜在的病原污染,且原料来源有限。单克隆抗体有可能取代ERIG和HRIG,但是其要用真核表达系统表达,表达量低,生产成本高,限制其进一步应用,因此,开发能替代HRIG,ERIG和单克隆抗体的基因工程抗体已十分迫切。单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)是现在研究最多的小分子抗体,它是由连接肽将抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)相连而成,是具有其母体抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。它具有分子小、体内半衰期短、可通过包涵体大量表达、易于基因操作等优点。吉林大学的陈晓旭等人制备了抗狂犬病毒糖蛋白的单链抗体scFv98H,但是以下两个缺点阻止了其进一步应用。第一个缺点是是动物保护率不能达到抗血清的水平,第二个缺点是scFv98H的C末端有HIS标签,HIS标签对人体是否有害存在争议,因此临床上研究的产品被要求不能带HIS标签。针对第一个缺点,通过查找文献,我们发现调换VH和VL的位置有可能提高单链抗体的保护率,因次根据scFv98H(VH-linker-VL)的序列,我们构建了新的单链抗体scFv98R(VL-linker-VH),以提高其保护率。针对第二个缺点,我们去掉了 scFv98H和scFv98R的C末端的HIS标签,新的抗体为scFv98N和scFv98RN。用RFFIT和小鼠保护实验比较这四种单链抗体的细胞水平上的中和活性和动物保护率,在这两个指标上scFv98N均为最优,且没有HIS标签,使其更符合药典里相关的要求。本文主要设计如下:(1)构建scFv98R、scFv98RN两种蛋白的原核表达质粒,并成功制备了scFv98R,scFv98RN,然后将它们与本组已有的scFv98H和scFv98N进行比较。通过RFFIT检测其中和活性,通过小鼠保护实验比较其动物保护力,发现在中和活性和动物保护率这两个方面scFv98N均为最优,且scFv98N没有HIS标签,符合药典要求,因此选择scFv98N进行下一步实验。(2)摸索并且优化scFv98N的纯化工艺条件。将Qxl阴离子交换层析介质作为纯化scFv98N的主要介质,对其pH、载量以及上样速度的各种条件进行摸索。再将复性后的蛋白进行单体和多聚体的分离。(3)研究scFv98N的复性工艺并优化其条件。由于scFv98N是以包涵体形式表达的,因此我们需要把包涵体溶解,将目的蛋白变性释放,然后再进行复性。用两种方式尝试scFv98N的复性。一种是柱上复性,但是经过对Qxl、SP、CM三种离子交换层析介质进行研究,并没有达到很好的复性效果。所以透析复性成为本实验的主要复性方法。对它进行起始浓度、pH等条件的优化。(4)通过以上研究确定了 scFv98N的纯化和复性工艺路线,根据此路线进行目标蛋白的纯化以及复性,将得到的样品再进行质量鉴定和分析,采用SDS-PAGE测其纯度及计算回收率,Western blot检测其是否具有抗原性,AB SCIEX TOF/TOF测样品的分子量,快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测样品的中和活性,最后检测细菌内毒素和外源性DNA的残留量。