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目的：研究益气活血方血清对骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)增殖活力的影响,以及经穴注射BMSCs联合益气活血中药促进糖尿病大鼠后肢缺血血管再生的机制,为临床中医血管外科防治下肢动脉缺血性疾病提供新的思路和方法。方法：(一)体外实验：采用全细胞贴壁培养法纯化BMSCs,用流式细胞术鉴定BMSCs。采集空白对照大鼠、益气药、活血药、益气活血方灌胃大鼠的含药血清,应用MTT法检测10%浓度以上四种不同含药血清对第3代BMSCs增殖活力的影响；以及5%、10%、20%不同浓度空白血清与益气活血含药血清对第3代BMSCs增殖活力的影响；(二)体内实验：80只SD大鼠随机分为8组：正常血糖假手术组、糖尿病大鼠假手术组、糖尿病大鼠缺血组、益气活血中药治疗组、局部注射BMSCs组、局部注射BMSCs+益气活血方治疗组、穴位注射BMSCs组、穴位注射BMSCs+益气活血方治疗组,每组10只。DM模型：采用空腹腹腔注射50.0mg/Kg的STZ；缺血模型：剥离切除DM大鼠左后肢股动脉和所有侧支血管。于术后2、7、14、21天进行大鼠一般行为学观察,记录血糖水平,体重等；应用PeriScan PIM型激光多普勒血流成像仪,比较各组间大鼠后肢血流变化；免疫组织化学法检测肌动蛋白(α-actin)、血小板内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PEC AM-1/CD31、血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)标记的血管密度；免疫组织化学检测血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)在肌肉组织中的表达量；(三)用ELISA去检测益气活血中药对后肢缺血大鼠血清VEGF、G-CSF、SDF-1浓度的影响。结果：(一)体外实验：采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态多为椭圆或长梭形,呈旋涡状生长。流式细胞术检测第三代BMSCs,CD44、CD106呈阳性表达,基本不表达CD45、CD34.(1)不同方含药血清培养BMSCs,在第2、4、5天细胞快速增长,均较前一天增长明显,第6天时活血方血清组与益气活血方血清组细胞增长已呈下降趋势,其他三组在第6天细胞增殖达最大,第7天时呈下降趋势。BMSCs去除基线增殖率组间比较,培养第2天时,各组间比较虽无差异,但活血方血清组达最大；第4天时,益气活血方组达最大,活血方血清组次之；培养第6天时,益气方血清组较其他三组大,益气活血方血清组次之,活血方血清组最低；(2)在不同浓度含药血清培养下,10%益气活血方血清培养BMSCs从第2天起呈快速增长,去除基线增殖率达最大(69.95±7.50%),而20%空白血清、20%益气活血血清组对BMSCs增殖活力的影响仅高于10%FBS组。(二)体内实验：在本实验中,本方法制造糖尿病模型,成模率为87.14%,成模率高,成模稳定；采用结扎并切除DM大鼠股动脉及其侧支血管的方法制造后肢缺血模型,存活率为88.52%。(1)一般行为学观察：缺血造模后的大鼠状态萎靡,术后患肢冰凉,颜色苍白,甚至紫暗,多数出现肢体跛行、溃疡；剥离切除DM大鼠左后肢股动脉组大鼠PUI值明显低于假手术组,造模成功；(2)各组PUI差值比较,穴位+中药组PUI差值大幅增加,缺血后肢情况改善最明显,其次为穴位注射组、局部+中药组,中药组与局部注射组改善相对较小；(3)各组术侧与健侧后肢a-actin、CD31表达量比较均有所升高；穴位注射BMSCs+中药组后肢缺血DM大鼠术侧骨骼肌中VEGF mRNA、bFGF mRNA表达量明显升高、a-actin、CD31表达量平均光密度较其他组最高,而vWF的表达下降最明显；(三)注射BMSCs缺血组、BMSCs联合益气活血中药组大鼠血清中VEGF,SDF-1, G-CSF质量浓度较其他组显著升高。结论：全细胞贴壁培养的大鼠BMSCs在细胞形态与表形表达上均具备BMSCs特征。(1)活血方血清对BMSCs增殖影响出现最早,益气方血清对BMSCs增殖影响持续时间最长,益气活血全方含药血清对培养BMSCs的体外增殖活力影响最大；10%益气活血中药含药血清可明显提高BMSCs的体外增殖能力；(2)经穴注射BMSCs联合益气活血中药能显著改善缺血DM大鼠后肢的血流灌注,可促进DM大鼠后肢缺血骨骼肌VEGF、 bFGF表达增加,血管内皮细胞与血管平滑肌细胞的增生,对预防动脉硬化有一定作用。(3)经穴注射BMSCs联合益气活血中药可明显促进大鼠血清中VEGF、SDF-1、G-CSF的表达。