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背景:骨结核是最常见的肺外结核之一,在骨关节结核中脊柱结核占50%以上,若治疗不当会导致严重的脊柱后凸畸形和神经功能障碍,甚至截瘫,危害极大。脊柱结核属中医学“阴疽”、“流痰”范畴,阳和汤是治疗阴疽、流痰的经典方,目前广泛应用于治疗骨科类疾病,尤其是骨结核治疗中,具有显著疗效。然而其治疗骨结核的作用机制研究,目前较为缺乏。本课题拟从临床研究和动物实验两个方面,基于中药“扶正祛邪”理论,探讨阳和汤治疗脊柱结核的免疫学机制,为开发利用中医药预防和治疗此类疾病提供新的思路。第一部分:临床研究（一）不同证型脊柱结核临床特征及免疫水平差异的研究目的:观察阳虚型和阴虚型脊柱结核患者的临床特点及免疫水平,比较两组之间的差异,为中医临床辩证论治提供客观依据。方法:采用横断面临床研究方法,对脊柱结核患者进行临床资料采集,包括人口学信息、临床症状、影像学资料、实验室常规检查及T细胞亚群检测。根据中医辩证分型将最终纳入研究的患者分为阳虚型和阴虚型两组,比较两组上述指标的差异。结果:共113例患者最终纳入本研究,其中阳虚组66例（58.4%）,阴虚组47例（41.6%）;人口特征学方面比较,两组性别分布和年龄均无明显差异;阳虚组平均病程5.67±2.16月高于阴虚组4.17±2.66月;阳虚组BMI指数16.73±3.87（kg/m~2）低于阴虚组19.12±5.05（kg/m~2）;症状比较:两组VAS评分、ODI指数以及脊髓损伤Frankel分级比较差异无统计学意义;影像学比较:两组在病变部位和累及椎体数方面比较差异无统计学意义,但阳虚组脓肿发生比例高于阴虚组;实验室检查比较:阳虚组患者贫血发和低白蛋白发生率均高于阴虚组。阳虚组血沉总体水平均低于阴虚组;T细胞亚群比较:阳虚组患者CD4+/CD8+低于阴虚组,差异有统计学意义。结论:脊柱结核阳虚型和阴虚型之间存在一定的差异,阳虚患者病程较长,椎旁脓肿发生率更高,营养状态和免疫水平更低,可以为临床辩证提供一定的参考。（二）阳和汤辅助手术治疗阳虚型脊柱结核的临床疗效及对免疫的影响目的:观察阳和汤治疗脊柱结核的临床疗效,比较两组治疗前后T细胞亚群和Th1/Th2细胞因子表达的差异。方法:66例阳虚型脊柱结核患者随机分为观察组（阳和汤+手术+化疗）和对照组（手术+化疗）,每组33人,两组均治疗12周,于治疗前（T0）、术后一周（T1）、术后4周（T2）、术后8周（T3）、术后12周（T4）5个时间点对患者进行临床评估并采集外周血进行检测分析,比较两组基线资料、疼痛和功能障碍评分、血沉、T细胞亚群比例、细胞因子水平、中医证候积分以及中医疗效。观察两组治疗期间不良反应情况。结果:观察组2例退出,1例脱落。对照组1例退出,2例脱落,两组各完成30例;两组患者基线资料比较,差异无统计学意义,具有可比性。VAS评分比较:在T0、T1、T2、T3、T4两组VAS评分随时间推移均成下降趋势,在T2、T3时,观察组低于对照组;ODI评分比较:两组ODI评分随时间推移均成下降趋势,在T2、T3、T4时,观察组低于对照组;ESR比较:两组ESR水平随时间推移成下降趋势,在T2时,观察组ESR指标低于对照组。中医证候积分比较:T1时两组中医证候积分较前增高,此后逐渐下降,在T2,T3时观察组低于对照组;T淋巴细胞亚群比较:T4时观察组CD4+、CD4+/CD8+较前均明显升高;且观察组CD4+、CD4+/CD8+高于对照组。Th1/Th2细胞因子比较:T4时观察组IL-10水平较T0时降低,且低于对照组;IFN-γ水平较T0升高,且高于对照组。中医疗效比较:T4观察组显效率为43.3.0%高于对照组20.0%;安全性方面比较,两组均无严重不良反应,观察组不良反应发生率低于对照组。结论:阳和汤辅助手术和化疗治疗脊柱结核可以明显改善患者临床症状,减轻炎症反应,提高患者免疫水平,有利于恢复Th1/Th2平衡。第二部分:实验研究（一）小鼠结核感染模型的构建和阳和汤药物成份的鉴定目的:建立小鼠结核分枝杆菌感染动物模型并进行验证,对实验所用药物阳和汤的成份和稳定性进行鉴定,为开展阳和汤治疗脊柱结核的体内实验研究奠定基础方法:将12只C57BL/6小鼠随机分为3组:空白对照组（Sham组）、H37Ra菌株感染模型组（TB组）、阳性药物异烟肼治疗组（INH组）,每组4只。TB组和INH组经尾静脉注入减毒型结核分枝杆菌H37Ra菌株10~6CFU 0.2m L;Sham组尾静脉注射0.2ml生理盐水。感染2周后开始灌胃给药,INH组使用0.2ml异烟肼配制药液;Sham组和TB组使用0.2ml等量生理盐水,连续给药4周后,所有小鼠处死,无菌操作下解剖小鼠肺脏,左肺进行组织荷菌量检测,右肺行病理切片和抗酸染色,给药期间观察并记录小鼠一般情况。采用通过高效液相色谱法对阳和汤药物有效成份及稳定性进行鉴定。结果:12只小鼠均完成本实验研究,模型组1只小鼠尾部穿刺部位出现红肿,1周后逐渐愈合。药物干预4周后Sham组、TB组和INH组肺脏组织的荷菌量分别是0,4.96±0.26,2.56±0.48（Lg CFU/m L）;与TB组比较,INH组肺脏组织荷菌量显著降低;肺脏病理学检查发现感染后小鼠肺脏组织出现炎性细胞聚集,炎性细胞以淋巴细胞为主,间质可见水肿,但均未见典型结核病变,抗酸染色可见细菌染色阳性;INH组病理学表现较TB组病变程度轻。HPLC分析了6个独立批次的阳和汤,重叠色谱图表明阳和汤药物稳定性可靠,并且识别了7种主要化学成分,分别为齐墩果酸、盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐、甘草苷、肉桂醛、汉黄芩素和6-姜酚。结论:小鼠H37Ra菌株感染模型构建成功,且对异烟肼药物治疗反应明显,本研究中所使用的阳和汤有效成份稳定,可进行下一步实验研究。（二）阳和汤对小鼠体内结核杆菌的抑制和免疫指标的调控目的:观察阳和汤联合异烟肼治疗对结核感染小鼠的组织脏器指数、组织荷菌量、组织病理学表现的影响,以及对小鼠脾脏T细胞因子INF-γ和IL-10的调控作用。方法:将40只C57BL/6小鼠随机分为5组:空白对照组（Sham组）、H37Ra菌株感染模型组（TB组）、阳性药物治疗组（INH组）、阳和汤治疗组（YHT组）;阳和汤+异烟肼治疗组（YHT+INH组）,每组8只;除Sham组以外,其余四组小鼠均采用尾静脉注射H37Ra菌株10~6CFU 0.2m L进行感染造模。感染2周后开始给药,INH组给予异烟肼溶液0.2ml灌胃、YHT组给予阳和汤浓缩液0.2ml灌胃,YHT+INH组同时给以上两种药灌胃,Sham组和TB组给予0.2ml生理盐水灌胃,连续灌胃8周。在药物干预第4周和第8周时,各组分别处死4只小鼠进行脏器重量指数测量和组织荷菌量检测;第8周时,处死各组剩余4只小鼠,取脾脏淋巴组织制成单细胞悬液,采用间接酶联免疫吸附测定法检测INF-γ和IL-10水平;同时取各组小鼠右肺组织进行病理学分析。结果:小鼠脏器指数比较:4周和8周周时肺脏和脾脏重量指数比较:与Sham组比较其余四组均显著增加;与TB组比较:INH、YHT、YHT+INH组显著降低;与INH组比较,YHT+INH组降低;脾脏重量指数比较:与Sham组比较,各组均显著增高;与TB组比较:INH、YHT、YHT+INH组显著降低;与INH组比较,YHT组增高;YHT+INH组显著降低。组间比较8周时低于4周;小鼠肺组织荷菌量比较:Sham组各个时间段均未检测到细菌。组间比较,与TB组比较:INH组、YHT+INH组治疗4周和8周时荷菌量均显著低于同期TB组。YHT组4周时与TB组比较无明显差异;8周时低于TB组;与INH组比较:4周和8周时,YHT组荷菌量均显著增高;YHT+INH组无明显差异。组内比较,与4周时比较8周时,TB组肺荷菌量较前升高;INH、YHT、YHT+INH组8周时肺荷菌量均较前下降,YHT组较前降低。YHT+INH组呈现出与INH组相似的趋势;小鼠脾淋巴细胞INF-γ和IL-10水平比较:与Sham组比较,TB组INF-γ表达显著升高,INH组INF-γ表达显著降低;与TB组比较,INH、YHT、YHT+INH组表达均显著降低;与INH组比较,YHT组、YHT+INH组显著升高;与Sham组比较TB、INH组IL-10表达显著降低;与TB和INH组比较,YHT、YHT+INH组IL-10表达显著增高;小鼠肺部组织HE染色结果显示:Sham组肺部组织结构正常,未见炎性细胞浸润,TB组肺脏组织出现炎性细胞聚集,炎性细胞以淋巴细胞为主,间质可见水肿;未见典型结核坏死性病变;与TB组比较,INH组、YHT组的组织炎症较轻,YHT+INH组炎性细胞聚集明显减少。结论:阳和汤联合异烟肼可以显著改善小鼠脏器重量指数,促进结核分支杆菌的清除,改善脏器病理损伤,其作用机制可能与调节Th1/Th2细胞因子水平有关。（三）阳和汤调控PI3K/Akt通路抑制小鼠结核病灶组织细胞凋亡目的:通过H37Ra菌株感染小鼠模型,观察阳和汤方是能否通过调控PI3K/Akt通路抑制感染病灶组织细胞凋亡,为阳和汤在治疗脊柱结核提供依据。方法:药物干预第8周时将所有小鼠处死,摘眼球取血,无菌操作下解剖小鼠肺脏。ELISA法检测血清TNF-α、Bax水平;实时聚合酶链式反应（PCR）检测肺组织中PI3K、AKT、Bax、Bcl-2 m RNA表达;免疫蛋白印记法（Westren Blot）检测肺组织中PI3K、p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2蛋白表达;TUNEL法检测肺组织细胞凋亡。结果:ELISA结果显示,与Sham比较,TB组小鼠血清中TNF-α、Bax含量显著升高,与TB组比较,YHT+INH组TNF-α、Bax含量显著降低,与INH组比较,YHT+INH组TNF-α、Bax含量降低。PCR结果显示,与Sham比较,TB组小鼠肺组织PI3K、AKT、Bax m RNA表达显著增加,Bcl-2 m RNA表达显著降低;与TB组比较INH+YHT组PI3K、AKT、Bax m RNA表达显著降低,Bcl-2 m RNA表达显著增加;与INH组比较,YHT+INH组Bax m RNA表达显著降低,Bcl-2 m RNA表达显著增加;Western blot结果显示,与Sham组比较,TB组肺组织PI3K、p-Akt、Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低;与INH组比较,YHT+INH组小鼠肺组织PI3K、p-Akt、Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2蛋白表达升高;TUNEL结果显示,与Sham组比较,TB组小鼠肺组织细胞凋亡显著增加,与TB组比较,YHT+INH组小组肺细胞凋亡指数显著降低。结论:阳和汤可以抑制小鼠感染病灶组织的细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路相关。