背景:百草枯（1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶二氯化物,paraquat,PQ）是世界上广泛使用的除草剂。虽然目前其水剂型已被我国禁用,但残留在环境中的PQ进入人体的机会较多,仍可导致机体损伤。由于其价格低廉和除草效果确切,在农业生产过程中仍有非法使用的现象,在临床上因误服或主动服用PQ导致中毒的病例也屡见不鲜,且预后较差。目前PQ中毒的损伤机制仍不清楚,尚无特效解毒剂。此外,医学研究中,PQ作为一种经典的自由基诱导剂,常用于构建氧化应激损伤相关模型。深入研究PQ中毒机制,探索新的分子靶点和信号通路,进而寻找有效的防治药物与措施,对临床PQ救治具有重要的现实意义,也对活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生物学效应的研究提供有益的借鉴和新的思路。肺是PQ毒性的主要靶器官,PQ通过多胺摄取系统选择性积聚在II型肺泡上皮细胞内,常导致严重的肺损伤。目前,PQ导致肺损伤机制尚不清楚。大量研究发现PQ导致肺损伤与细胞凋亡、DNA损伤、细胞内钙超载、氧化应激和线粒体损伤等相关。线粒体参与细胞内物质代谢、ATP的生成及凋亡等多种过程。在产生ATP的过程中,线粒体电子传递链上传递的电子会有少量不可避免地“漏出”,并与氧反应生成超氧阴离子自由基,即线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species,mtROS）。虽然PQ诱导ROS的来源存在争议,一般认为来自mtROS。研究证实,PQ可以通过生成大量ROS导致DNA结构的损伤。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）是一种进化上高度保守的、有多种生物学功能的核酶,广泛参与DNA损伤修复、转录调控、氧化应激介导的细胞死亡、代谢及免疫调节过程。其中,PARP1是PARP家族第一个被发现的成员,是PARP家族最主要的亚型,其最主要的生化功能是进行多聚ADP核糖化（PAR）修饰从而修复受损的DNA。虽然PARP1介导的PAR修饰参与了DNA损伤修复过程,但会大量消耗NAD+和ATP。在某些环境下,PARP1的过度激活还能介导细胞死亡。PQ暴露后是否会导致PARP1的过度激活及PAR修饰,PARP1激活是否参与了PQ导致的氧化应激与凋亡,PARP1特异性抑制剂能否发挥对PQ诱导细胞损伤的保护作用,如果发挥保护作用其作用机制是什么,上述问题均有待阐明。Sirt1是细胞内NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,参与了细胞内多种反应的调控,如细胞内氧化还原稳态的调节。有研究提示PQ暴露可以下调Sirt1,且抑制Sirt1可以促进PQ诱导细胞内ROS的生成,过表达Sirt1可以通过抑制氧化应激减轻PQ毒性,然而PQ通过何种途径抑制Sirt1并不清楚。由于PARP1可以抑制Sirt1的功能,PQ导致Sirt1的抑制是否与PARP1有关也有待研究。绿原酸（Chlorogenic acid,CA）是一种重要的膳食多酚,具有多种重要的药理作用。近年研究提示CA发挥药理学保护作用的机制可能与Sirt1激活有关,CA是否能通过提升Sirt1水平减轻PQ导致的细胞凋亡仍需要进一步研究。综合上述研究,我们提出的科学假设是:在PQ诱导肺损伤模型中,PQ暴露后导致肺上皮细胞中DNA发生严重损伤,引起PARP1过度激活,进而通过抑制Sirt1提高mtROS的水平,导致线粒体功能紊乱和氧化应激,最终引起细胞凋亡,导致肺损伤的发生发展。目的:1.明确PQ诱导肺上皮细胞线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡的剂量效应关系。2.研究PARP1在PQ诱导A549细胞凋亡中的作用及机制。3.探讨PQ暴露的A549细胞中Sirt1在PARP1介导细胞凋亡中的作用。4.明确mtROS在PARP1/Sirt1通路调控PQ导致凋亡中的作用。5.探讨Sirt1潜在激活剂CA对PQ诱导A549细胞凋亡的保护作用及其机制。方法:1.构建体外PQ导致损伤的细胞模型:选择人源性肺Ⅱ型上皮A549细胞系为受试细胞,分别用0、20、40、80、160和320μM的PQ处理后用PrestoBlue^?检测细胞活力的变化,在光镜下观察细胞损伤状态,Tunel染色和AnnexinV/PI法检测细胞凋亡,用Fluo4探针测定细胞内Ca²⁺含量,用DHE,DCFH-DA和MitoSOX分别检测细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的水平,用JC-1染色检测线粒体膜电位从而评估线粒体功能。根据上述检测指标确定具有代表性的PQ处理方法。2.PARP1在PQ致细胞凋亡中的作用:选用PARP1特异性抑制剂AG14361（AG）作为PQ诱导细胞损伤和凋亡的干预手段,通过细胞活力检测筛选AG潜在的保护剂量,western blot检测蛋白的PAR修饰从而评估PARP1的功能,检测细胞凋亡评估AG对PQ诱导凋亡的影响,测定细胞内Ca²⁺含量观察AG对PQ引起钙超载的影响,检测细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的水平评估AG对PQ导致氧化应激的作用。用罗丹明123和JC-1检测线粒体膜电位从而评估线粒体功能,通过透射电镜观察线粒体的亚显微结构评估PQ对线粒体结构的损伤情况。另外,为了研究AG后处理的干预效果,在PQ处理细胞12 h后,再加入AG共处理12 h并检测上述指标。3.Sirt1在PARP1介导PQ致肺上皮细胞凋亡中的作用:通过慢病毒感染的方法分别构建阴性对照细胞ShNC和沉默Sirt1的细胞ShSirt1,western blot检测Sirt1的水平验证沉默的效率。为了明确Sirt1在PQ导致细胞损伤和凋亡中的作用,用PQ处理ShNC和ShSirt1细胞24 h后,检测细胞凋亡和mtROS的含量。用AG干预PQ导致的细胞凋亡后检测Sirt1的蛋白水平。为了明确Sirt1在AG抑制PQ致细胞损伤和凋亡过程中的作用,AG干预PQ暴露的ShNC和ShSirt1细胞后分别检测细胞活力、细胞凋亡、细胞内Ca²⁺含量、H₂O₂和mtROS的水平、线粒体膜电位的变化。4.MtROS在PQ致细胞凋亡中作用及调控机制:使用线粒体靶向的抗氧化剂MitoTEMPO作为PQ导致细胞损伤和凋亡的干预手段,通过检测细胞活力筛选有潜在保护效果的MitoTEMPO浓度。测定细胞凋亡评估MitoTEMPO对PQ诱导细胞凋亡的影响,测定细胞内Ca²⁺水平判断MitoTEMPO对PQ导致钙超载的影响,分别检测细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的水平明确MitoTEMPO对氧化应激的影响,罗丹明123和JC-1探针检测线粒体膜电位以评估线粒体功能,通过透射电镜观察线粒体的亚显微结构从而评估线粒体结构的损伤情况。另外,为研究MitoTEMPO后处理的干预效果,PQ处理细胞12 h后再在PQ存在的情况下加入MitoTEMPO进行干预,继续处理12 h后检测上述指标的变化。为了进一步研究PQ导致细胞凋亡中mtROS的调控机制,在PQ暴露的ShNC和ShSirt1细胞中分别用AG和/或MitoTEMPO进行干预,检测细胞凋亡、细胞内Ca²⁺含量,测定细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的含量,检测线粒体膜电位的变化。5.Sirt1潜在激活剂CA对PQ诱导细胞凋亡的保护作用及机制:通过检测细胞活力筛选CA的最大无损害剂量。CA预处理24 h后再将细胞暴露于PQ,通过细胞活力检测确定CA的保护效果。分别检测细胞凋亡和细胞内Ca²⁺水平,检测细胞内O₂^-·和mtROS的含量,用mBCl探针检测细胞内GSH的含量,透射电镜观察线粒体的亚显微结构,MitoTracker Red标记线粒体后评估线粒体的数量,CellTiter-Glo^?试剂盒测定细胞内ATP水平,western blot检测细胞色素C、Bax、活化的Caspase 9和3、Nrf2、SOD1、SOD2和Sirt1的蛋白含量。为了确定CA对Sirt1含量的影响,CA处理细胞0,6,12和24 h后用western blot检测Sirt1的水平。另外,为了阐明Sirt1的功能,用CA分别处理ShNC和ShSirt1细胞24 h后再将细胞暴露于PQ,检测细胞凋亡和ATP含量的变化。结果:1.成功建立了PQ暴露的细胞模型。不同浓度的PQ处理24 h引起细胞损伤具有剂量效应关系,40μM以上浓度的PQ能降低细胞活力,导致细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS含量增加;80μM以上的PQ引起细胞凋亡,使线粒体膜电位降低;160μM以上的PQ处理后在光镜下呈现细胞损伤状态,引起Tunel染色阳性和细胞内钙超载。综合以上指标,160μM的PQ处理24 h具有很好的代表性,作为PQ导致细胞损伤的模型。2.PARP1在PQ导致的细胞凋亡过程中具有关键作用。PARP1抑制剂AG可以减轻PQ导致细胞活力损伤和PAR修饰,降低Tunel阳性率,减轻PQ导致的细胞凋亡和细胞内钙超载,降低PQ诱发的mtROS的含量,抑制PQ导致的线粒体膜电位的降低,改善PQ对线粒体结构的损伤。另外,AG后处理也能对上述指标有一定程度的改善。然而,AG对PQ诱发的细胞内O₂^-·含量无影响,能进一步增加PQ诱发的细胞内H₂O₂的含量。3.Sirt1在PARP1介导PQ暴露细胞的凋亡中发挥了重要作用。本研究发现,PQ能够下调Sirt1表达,沉默Sirt1增加了PQ导致的细胞凋亡,增加PQ诱导的mtROS的含量。在PQ导致细胞损伤模型中,沉默Sirt1后AG的细胞活力保护作用消失、抗凋亡作用消失、抑制钙超载的作用减弱、促进PQ产生H₂O₂的作用消失、抑制PQ诱发的mtROS的作用消失、对线粒体膜电位的保护作用消失。4.MtROS在PQ导致的凋亡中发挥核心作用。MitoTEMPO抑制PQ导致的细胞活力受损,减轻PQ导致的细胞凋亡和细胞内钙超载,降低PQ暴露后细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的含量,抑制PQ引起的线粒体膜电位的降低,改善PQ导致的线粒体结构的损伤。MitoTEMPO后处理对上述大多数指标也有一定程度的改善。用AG和MitoTEMPO同时或MitoTEMPO单独干预Sirt1沉默细胞后,PQ导致的细胞凋亡和钙超载均明显减轻,PQ暴露的细胞内O₂^-·、H₂O₂和mtROS的含量均明显下降,PQ对线粒体膜电位的损伤也明显缓解。5.CA通过提高Sirt1水平对PQ诱导细胞凋亡具有显著保护作用。CA可以增加Sirt1水平,CA预处理抑制PQ导致的Sirt1蛋白表达降低,提高细胞内抗氧化相关蛋白的表达,增加细胞内GSH的含量,降低PQ暴露细胞中的O₂^-·和mtROS水平,减轻氧化应激,抑制PQ导致的线粒体数量减少和线粒体结构损伤,改善线粒体功能,抑制PQ暴露导致的钙超载,降低PQ暴露细胞中凋亡相关蛋白的水平,最终发挥对PQ导致细胞凋亡的保护作用。而沉默Sirt1后CA不能抑制PQ引起的线粒体功能损伤和细胞凋亡。结论:1.PQ暴露导致的肺上皮细胞氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡具有剂量效应关系。2.PQ暴露导致PARP1过度激活,PAR修饰增加,PARP1的激活参与了PQ导致的细胞凋亡。3.PQ暴露下调Sirt1表达,沉默Sirt1促进PQ导致的凋亡,Sirt1可能是PARP1调控PQ诱导细胞凋亡的重要下游效应分子。4.MtROS过量生成是PQ导致氧化应激和细胞凋亡的主要原因,PARP1和Sirt1在mtROS生成过程中分别发挥正调控和负调控的关键作用。5.CA可能通过提高Sirt1水平保护线粒体功能并减轻氧化应激,最终抑制PQ导致的细胞凋亡。6.PARP1/Sirt1/mtROS可能是PQ中毒机制的关键分子靶点和通路,PARP1抑制剂AG、Sirt1激活剂CA和mtROS清除剂MitoTEMPO可能是PQ中毒的潜在救治药物。