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研究背景及目的:中耳胆脂瘤是一种良性角化和过度增殖鳞状上皮病变,能破坏临近骨质,引起听力下降、面神经麻痹、耳后骨膜下脓肿、迷路瘘、细菌性迷路炎以及颅内并发症:脑脓肿,乙状窦血栓性静脉炎等,严重者危及生命。手术后仍有30%的患者复发,因此,迫切需要基于分子机制开发非手术治疗方案。迄今为止,中耳胆脂瘤发病机制确切细胞和分子机制尚不明确。为改善胆脂瘤的治疗,临床上迫切需要有用的生物标志物。BMI1属于多梳蛋白质家族成员,有研究发现体外野生型BMI1可以导致HaCaT细胞（人类角质化细胞）恶性转化。BMI1表达失调导致角质化细胞变性及肿瘤化,其可能机制是缩短细胞周期和增加细胞移动性。在胆脂瘤上皮层中,角质细胞占整个上皮层细胞的95%,具有强烈的增殖和分化能力。近期研究显示,BMI1在胆脂瘤中呈高表达,且其对于胆脂瘤的发展至关重要,提示BMI1可能为胆脂瘤患者的治疗提供新的靶点。微小RNA（miRNA）是一种短的非编码RNA分子,在基因表达的转录后调控中起作用,它们可以通过在3’非翻译区与其靶向的信使RNA（mRNA）结合来启动蛋白质翻译抑制。近年来,由于miRNA参与多种细胞通路,包括细胞增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭等,越来越多的研究人员开始关注miRNA在胆脂瘤中的研究。本课题前期通过生物信息学预测与BMI1存在靶向关系的miRNA,结合以往文献筛选出miR-1297和miR-26a-5p两个与胆脂瘤可能相关的miRNA。探讨miR-1297和miR-26a-5p是否能够通过靶向调控BMI1参与胆脂瘤的发生和发展,进一步为胆脂瘤的临床干预提供理论依据。研究目的1.研究BMI1在胆脂瘤组织中的表达情况,下调BMI1对胆脂瘤角质细胞的增殖、迁移侵袭、细胞凋亡、细胞周期及其相关蛋白中的影响;2.研究miR-1297及miR-26a-5p在胆脂瘤角质细胞的表达情况,验证miR-1297及miR-26a-5p靶向BMI1影响胆脂瘤角质细胞的生物学行为;第一部分 BMI1在胆脂瘤组织中的表达及其在胆脂瘤角质细胞中的功能实验研究方法:1.qRT-PCR和Western blot实验检测BMI1在胆脂瘤患者组织中表达情况;2.提取胆脂瘤角质细胞,无血清培养基中进行培养。显微镜下观察细胞形态并进行角质细胞角蛋白抗体免疫荧光化学方法检测对角质细胞的性质进行鉴定;3.实验分组:si-NC组、si-BMI1#1 组和si-BMI1#2 组;4.Western blot实验检测BMI1 siRNA转染效率;5.MTT、EDU和克隆形成实验检测胆脂瘤角质细胞的增殖能力;6.Transwell小室实验和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力;7.Western blot检测上皮间质转化（EMT）标志蛋白E-cadherin、N--cadherin和Vimentin的表达量;8.流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率;9.Western blot检测细胞周期、凋亡、侵袭和迁移相关蛋白Cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、MMP-2 和MMP-9 表达量。结果:1.临床标本中,胆脂瘤组织中BMI1 mRNA和蛋白表达水平显著高于耳后正常皮肤组织。2.采用无血清培养基培养可获得足够数量的胆脂瘤角质细胞,利用角蛋白抗体检测提取获得的胆脂瘤角质细胞的纯度可达90%以上,可用于后续实验。3.通过转染BMI1 siRNA,发现BMI1的表达明显下降。细胞增殖实验结果显示,转染BMI1 siRNA后胆脂瘤角质细胞OD值、EdU阳性率、克隆形成细胞数均明显下降（P＜0.05）。4.细胞侵袭迁移实验结果显示转染BMI1 siRNA后迁移和侵袭胆脂瘤角质细胞数明显减少,且划痕愈合率明显降低（P＜0.05）。5.EMT实验显示转染BMI1 siRNA后胆脂瘤角质细胞中E-cadherin的表达明显升高,而N-cadherin和Vimentin的表达明显降低（P＜0.05）。6.细胞周期结果显示转染BMI1 siRNA后G0/G1期细胞比例明显增多,而S期细胞比例明显减少,且细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。7.Western blot结果显示转染BMI1 siRNA胆脂瘤角质细胞中Cyclin D 1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达明显下调,而Bax的表达明显上调（P＜0.05）。第二部分 miR-1297靶向BMI1影响胆脂瘤角质细胞的生物学行为方法:1.生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因与RIP实验检测miR-1297和BMI1的靶向关系。2.qRT-PCR检测miR-1297在胆脂瘤患者组织中的表达情况;3.实验分组:miR-NC组、miR-1297 组、miR-1297+pcDNA组和miR-1297+BMI1 组;4.Western blot检测miR-1297 对BMI1 表达的影响;5.MTT、EDU和克隆形成实验检测胆脂瘤角质细胞的增殖能力;6.Transwell小室实验和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力;7.流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率;8.Western blot检测细胞中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、MMP-2 和MMP-9 蛋白的表达。结果:1.miR-1297和BMI1存在靶向关系。miR-1297在胆脂瘤患者组织中呈低表达。2.转染miR-1297mimics胆脂瘤角质细胞中BMI1蛋白表达明显低于对照组,同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞中BMI1蛋白表达几乎回到对照组水平（P＜0.05）。3.在细胞增殖实验中,转染miR-1297mimics后胆脂瘤角质细胞中OD值、EdU阳性率、克隆形成细胞数均明显减少（P＜0.05）;同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞OD值、EdU阳性率、克隆形成细胞数均明显增多（P＜0.05）。4.在细胞迁移侵袭实验中,转染miR-1297mimics后迁移和侵袭胆脂瘤角质细胞数明显减少,且划痕愈合率明显降低（P＜0.05）;同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒迁移和侵袭胆脂瘤角质细胞数明显增多,且划痕愈合率明显升高（P＜0.05）。5.在上皮间质转化实验中,转染miR-1297mimics后胆脂瘤角质细胞中E-cadherin的表达明显升高,而N-cadherin和Vimentin的表达明显降低（P＜0.05）;同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞中E-cadherin的表达明显降低,而N-cadherin和Vimentin的表达明显升高（P＜0.05）。6.细胞周期结果显示:转染miR-1297mimics后胆脂瘤角质细胞G0/G1期细胞比例明显增多,而S期细胞比例明显减少,且细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒后胆脂瘤角质细胞G0/G1期细胞比例明显减少,而S期细胞比例明显增多,且细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。7.Western blot结果显示,转染miR-1297mimics后胆脂瘤角质细胞中Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达明显下调,而Bax的表达明显上调（P＜0.05）;同时转染miR-1297mimics和BMI1过表达载体质粒后胆脂瘤角质细胞胆脂瘤角质细胞中Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达明显上调,而Bax表达明显下调（P＜0.05）。第三部分 miR-26a-5p靶向BMI1影响胆脂瘤角质细胞的生物学行为方法:1.生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因与RIP实验检测miR-26a-5p和BMI1的靶向关系。2.qRT-PCR检测miR-26a-5p在胆脂瘤患者组织中的表达情况;3.实验分组:miR-NC组、miR-26a-5p组、miR-26a-5p+pcDNA组和miR-26a-5p+BMI1 组;4.Western blot检测miR-26a-5p对BMI1 表达的影响;5.MTT、EDU和克隆形成实验检测胆脂瘤角质细胞的增殖能力;6.Transwell小室实验和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力;7.流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率;8.Western blot检测细胞中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、MMP-2 和MMP-9 蛋白的表达。结果:1.miR-26a-5p和BMI1存在靶向关系,且miR-26a-5p在胆脂瘤患者组织中呈低表达。2.转染miR-26a-5pmimics胆脂瘤角质细胞中BMI1蛋白表达明显低于对照组,同时转染miR-26a-5pmimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞中BMI1蛋白表达几乎回到对照组水平（P＜0.05）。3.在细胞增殖实验中,转染miR-26a-5pmimics后胆脂瘤角质细胞中OD值、EdU阳性率、克隆形成细胞数均明显减少（P＜0.05）;同时转染miR-26a-5p mimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞OD值、EdU阳性率、克隆形成细胞数均明显增多（P＜0.05）。4.在细胞迁移侵袭实验中,转染miR-26a-5p mimics后迁移和侵袭胆脂瘤角质细胞数明显减少,且划痕愈合率明显降低（P＜0.05）;同时转染miR-26a-5pmimics和BMI1过表达载体质粒迁移和侵袭胆脂瘤角质细胞数明显增多,且划痕愈合率明显升高（P＜0.05）5.在上皮间质转化实验中,转染miR-26a-5p mimics后胆脂瘤角质细胞中E-cadherin的表达明显升高,而’N-cadherin和Vimentin的表达明显降低（P＜0.05）;同时转染miR-26a-5p mimics和BMI1过表达载体质粒胆脂瘤角质细胞中E-cadherin的表达明显降低,而N-cadherin和Vimentin的表达明显升高（P＜0.05）。6.细胞周期结果显示:转染miR-26a-5p mimics后胆脂瘤角质细胞G0/G1期细胞比例明显增多,而S期细胞比例明显减少,且细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;同时转染miR-26a-5pmimics和BMI1过表达载体质粒后胆脂瘤角质细胞G0/G1期细胞比例明显减少,而S期细胞比例明显增多,且细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。7.Western blot结果显示,转染miR-26a-5p mimics后胆脂瘤角质细胞中Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达明显下调,而Bax的表达明显上调（P＜0.05）;同时转染miR-26a-5p mimics和BMI1过表达载体质粒后胆脂瘤角质细胞胆脂瘤角质细胞中Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达明显上调,而Bax的表达明显下调（P＜0.05）。结论:1.与耳后正常皮肤组织相比,BMI1在胆脂瘤组织中呈高表达,miR-1297和miR-26a-5p呈低表达。2.敲低BMI1抑制胆脂瘤角质细胞的增殖、周期进程、EMT、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。3.miR-1297和miR-26a-5p可靶向调控BMI1抑制胆脂瘤角质细胞的增殖、周期进程、EMT、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。