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成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences, CRISPR)的相关蛋白(CRISPR-associated, Cas)Cas9,是一个RNA引导的核酸内切酶,其利用RNA与DNA间的碱基互补配对特异性识别并切割有合适原间隔区临近基序(protospacer adjacent motif, PAM)序列的双链DNA。当Cas9需要切割不同的靶标DNA时,只需要改变引导RNA中的20 nt(nucleotide)引导序列,这种可程序化设计和简便性使得CRISPR/Cas9技术已发展成一种重要的基因编辑工具,并已广泛应用于多种生物。作为目前应用最为广泛的来自于Streptococcus pyogenes的Cas9 (SpCas9),它特异性识别5’-NG1G2-3’的PAM序列。本研究首次发现在较高SpCas9浓度的体外酶切反应中,只需要G1存在SpCas9即可对DNA产生有效切割,并通过将DNA与PAMmer (PAM-presenting oligonucleotides)退火使SpCas9体外酶切不再受限于PAM序列。这将有助于提升SpCas9的体外应用潜力。SpCas9利用HNH和RuvC结构域分别切割DNA的互补链和非互补链,切割位点均位于NGG上游第三个和第四个碱基之间,产生平末端。本研究通过改变sgRNA和NGG的相对位置,并对SpCas9酶切产物进行末端测序,初步揭示了SpCas9酶切位点的选择机制。其中,SpCas9在互补链的酶切位点完全由sgRNA位置决定,在非互补链的酶切位点则由sgRNA和NGG位置共同决定。另外,本研究还发现,在体外酶切反应中NGG位置是导致SpCas9脱靶酶切的重要因素,当NGG与原间隔区重叠一个碱基或间隔一个、两个甚至三个碱基时, SpCas9都能对DNA产生有效切割。但是,在NGG位置改变的情况下,SpCas9对靶标序列与sgRNA引导序列碱基错配的容忍程度明显降低。并观察到DNA构型会影响SpCas9的脱靶效应。体外酶切反应中,SpCas9在脱靶位点对超螺旋环形DNA的切割活性明显高于线性DNA。这些发现将有助于进一步拓展人们对SpCas9酶切特征的认识。另一方面,SpCas9相对于II型限制性内切酶具有更高的特异性和更低的限制性将使得其应用更为广泛。而且,随着测序技术的发展,借助生物信息学分析,人们对自然界中丰富的具有重要应用潜力的天然产物生物合成基因簇充满期待。为了对这些基因簇进行研究,常常需要对其进行克隆和异源表达。本研究基于SpCas9和Gibson assembly DNA体外组装技术,通过SpCas9和DNA体外组装技术成功实现了对海洋来源希瓦氏菌(Shewanella psychrophila) WP2基因组cosmid中未知Tetronate类次级代谢产物生物合成基因簇的一步克隆,并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达发现了该基因簇可能的代谢产物。同时,还利用该技术分步拼接克隆了氨基糖苷类抗生素——西索霉素生物合成基因簇。这两个基因簇的成功克隆表明基于SpCas9和Gibson assembly体外基因编辑技术对较大基因片段,特别是在基因组上不连锁基因簇的精确克隆变得更为便利。