【摘 要】
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microRNA(mi RNA)是一种重要的肿瘤标志物,它的表达失调与肿瘤发生密切相关。mi RNA在早期肿瘤细胞中的表达水平很低,亟需发展超灵敏的检测方法。荧光修饰的DNA探针由于设计简单和响应速度快而被广泛应用于mi RNA的检测。然而,传统的荧光DNA探针不涉及荧光信号增强,对低水平的mi RNA检测能力有限。表面增强拉曼(SERS)是一种非破坏性的分析方法,凭借其超高的灵敏度在微量生物分子
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microRNA(mi RNA)是一种重要的肿瘤标志物,它的表达失调与肿瘤发生密切相关。mi RNA在早期肿瘤细胞中的表达水平很低,亟需发展超灵敏的检测方法。荧光修饰的DNA探针由于设计简单和响应速度快而被广泛应用于mi RNA的检测。然而,传统的荧光DNA探针不涉及荧光信号增强,对低水平的mi RNA检测能力有限。表面增强拉曼(SERS)是一种非破坏性的分析方法,凭借其超高的灵敏度在微量生物分子检测中发挥了重要作用。本文将介孔二氧化硅(MSNs)纳米材料、金属增强荧光效应(MEF)和SERS技术相结合,基于布尔逻辑“AND”运算构建了一种功能DNA纳米探针,实现了超灵敏检测mi R-21和鉴别肿瘤细胞。本论文主要包含以下两个部分:(1)构建了一种基于杂交链式反应(HCR)的信号扩增策略,利用增强的荧光信号和SERS信号对溶液中的mi R-21进行灵敏检测。发夹探针DNA2序列的一端连接了银纳米颗粒(Ag NPs),发夹探针DNA3使用ROX荧光分子进行标记。在mi R-21不存在的情况下,由于DNA3中的ROX荧光分子与黑洞淬灭剂(BHQ)距离很近,因此荧光被有效猝灭。在mi R-21的存在下,DNA2-Ag的发夹结构被打开并和发夹DNA3-ROX-BHQ开始杂交,通过HCR生成DNA长链。HCR产物使得ROX荧光分子(也是拉曼报告分子)和Ag NPs聚集,Ag NPs的金属增强荧光效应和局域表面等离子体共振(LSPR)效应造成荧光信号和拉曼信号显著增强。该方案为低表达mi R-21的灵敏检测提供了一种有效的方法。(2)设计了一种基于布尔逻辑“AND”运算的纳米机器(FOMNs)对细胞中的mi R-21实现超灵敏检测。首先,将发夹探针DNA3-ROX-BHQ装载于MSNs孔内,然后使用DNA1封装介孔防止探针泄露。具有端粒延长端的DNA1可在端粒酶和d NTPs的存在下自主延伸,然后形成刚性发夹结构脱离MSNs表面。在端粒酶和mi R-21同时存在的情况下,DNA2-Ag的发夹结构被mi R-21打开并与释放的DNA3-ROX-BHQ杂交开启HCR。在溶液中,通过检测增强的荧光信号和SERS信号可对mi R-21实现超灵敏检测,检测限(LOD)分别为5.0×10-13M和5.0×10-15 M。在细胞实验中,通过荧光信号可对不同肿瘤细胞进行分型和对mi R-21进行定位;更重要的是,通过SERS技术我们对单细胞中mi R-21的表达水平进行了更灵敏的测定。
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