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以天山雪莲花药为材料,系统研究了其愈伤诱导与再生体系建立的过程,对花药培养阶段的影响因素进行了探讨,并对天山雪莲和莴苣原生质体分离的条件进行了优化,在此基础上对天山雪莲与莴苣原生质体进行融合,为天山雪莲新种质选育奠定了基础,实验结果如下:
1.天山雪莲花药培养最适宜的花期是花蕾期,比盛花期诱导率高,且诱导出的愈伤组织质量好。在进行低温预处理7天后的诱导率较好,褐变率较低,综合效果最好。天山雪莲花药培养MS培养基附加激素组合2,4-D0.5mg/L+6-BA1mg/L诱导天山雪莲花药愈伤的效果最好,诱导率达到34%,显著高于其他组合。
2.天山雪莲种子最佳消毒处理为75%C2H5OH处理50s,0.5%HgC12处理6min,15%H202处理30min,无菌水冲洗6次,发芽率和污染率分别为46.15%和45%。
3.天山雪莲原生质体分离最优的方案为1.5%纤维素酶,1.0%果胶酶,0.2%离析酶,9%甘露醇,在25℃黑暗条件下振荡酶解12h的原生质体产量最高为9.073×105个·g-1,原生质体活力为87.95%,有活力的原生质体数目为7.98×105个·g-1。
4.天山雪莲在继代培养10-12天左右进行酶解分离原生质体是最佳的。原生质体产量为8.89×105个·g-1,原生质体活力为87.1%。
5.以莴苣无菌苗的幼叶为材料,研究了不同的分离材料、质壁分离时间、苗龄、酶液组合、酶解时间及酶液渗透压等对原生质体分离效果的影响。结果表明:幼叶在含有13%甘露醇的CPW溶液里质壁分离2h,获得的原生质体产量存活率均高于其他质壁分离时间,为5.04×105个·g-1;苗龄为20d的幼叶分离得到的原生质体质量高,原生质体呈圆形、内含物多、活力强;酶液组合为1.0%纤维素酶+0.2%离析酶,25℃黑暗条件下酶解12h可获得大量有较高活力的原生质体;酶解液中添加浓度为9%的甘露醇较适合原生质体分离。
6.PGE4000诱导天山雪莲与莴苣进行原生质体融合的最适浓度为30%,诱导融合率为8.3%。