在现代体内药物分析工作中,80%左右的工作量及研究经费用于生物样品的前处理及分析样品制备等步骤。本文基于在线固相萃取前处理技术,实现了样品前处理的自动化,建立了系列“准确、灵敏、高通量”的分析方法,为体内药物监测及药代动力学研究提供有力的技术支持。首先,本研究探讨了全自动在线固相萃取-高效液相法用于测定小鼠血浆中补骨脂二氢黄酮甲醚的浓度。本方法简化了血浆样品繁琐的前处理步骤,提高了分析的速度及效率,实现了对目标化合物的较高回收率。本研究采用的CapcellMF Ph-1柱可有效去除血浆样品中的基质,且对补骨脂二氢黄酮甲醚的富集效果较好；在小鼠血浆中补骨脂二氢黄酮甲醚浓度测定过程中,最低定量限可低至20ng/ml,其选择性、线性、精密度、准确度及回收率均较好。补骨脂二氢黄酮甲醚在小鼠体内表现为吸收较快、清除较快、生物利用度较低的药代动力学特征。在线固相萃取-高效液相生物分析方法的多参数优化是方法学建立中的至关重要的步骤。本论文应用响应面分析法(RSM)对影响在线固相萃取过程中的若干因素进行了系统优化；按照影响程度由大到小依次为：洗脱剂pH值(pH)>转移时间(t(T))>基质洗脱时间(t(M))>洗脱剂流速(F)；该方法得到的最优条件组合大大提高了分析结果的准确性与可靠性。在响应面优化的基础上建立的在线固相萃取-高效液相色谱分析法能够快速、准确的测定小鼠血浆中高活性生物碱WM-5的浓度,整个分析时间8min;WM-5的最低定量限为20ng/ml。本方法简化了血浆样品繁琐的前处理步骤,实现了全自动化生物分析过程,提高了分析的速度及效率。在上述“准确、高效、快速”的单个目标分析物的分析方法基础上,本文针对临床应用最多的、具有不同理化参数的系列心血管类药物,系统地探讨了在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱系统方法学的适应性。基于心血管类药物物理化学参数的差异(如分子量,1ogP,pKa等),本文系统考察了不同在线固相萃取柱的提取效率及相应的色谱分析与质谱参数,并进行了条件优化。实验结果显示：采用反目LiChrosphe(?)RP-18ADS柱作为在线固相萃取柱,可有效实现目标化合物群的保留与分离,且所用的分析条件温和(pH9.5醋酸铵缓冲液上样,pH3.5醋酸铵缓冲液洗脱),避免了血浆中蛋白的沉淀现象；经反冲后,对分析柱系统进行梯度洗脱,可有效实现10个不同极性的心血管类药物的同步色谱分离；整个分析时间11min,未见内源性基质与其他物质的干扰：其最低定量限、精确度、准确度、回收率与基质效应均优于文献报道的普通液相色谱分析结果。最后,本文利用在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱系统对当前药物分析领域中一类较难分析的化合物-核苷类抗病毒药物进行了方法学的系统研究。由于此类化合物的极性极大、水溶性好,其药代动力学研究存在多种困难,特别是样品前处理过程中的基质去除、目标分析物的有效提取等。针对临床治疗艾滋病的“鸡尾酒”处方中常用的核苷类逆转录酶抑制剂(齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷、恩曲他滨),建立了高效的在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱分析系统：以混合型阳离子交换柱Oasis(?) MCX为在线固相萃取柱,优化了流动相系统、固相萃取系统与分析系统,实现四个化合物有效保留与色谱分离；整个分析时间10min,未见内源性基质与其他物质的干扰；其最低定量限、精确度、准确度、回收率与基质效应均满足FDA对生物样本分析的要求。同时,针对抗病毒治疗药物-利巴韦林及其前药Taribavirin,本文建立了一种新型的在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱分析法：自主设计了基于半化学吸附的在线固相萃取柱-苯硼酸固相萃取柱;经对色谱及质谱条件的优化,实现生物样品中的利巴韦林与Taribavirin的有效保留,并利用酸性洗脱剂有效实现了两者的色谱分离。该系统所用有机相比例小,有效避免了血浆中的蛋白沉淀,其最低定量限、精确度、准确度、回收率与基质效应均优于文献报道的普通色谱分析结果。