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目的:采用紫杉醇诱导法构建人宫颈癌细胞HeLa的耐药亚株HeLa/Tax,研究中药通关藤C21 甾体苷元 MT1(11 α-O-tigloyl-12 β-O-acetyl-tenacigenin B)、MT2(11 α-O-2-methyl.butanoyl-12 β-O-tigloyl-tenacigenin B)逆转肿瘤细胞多药耐药的作用和可能机制;利用Caco-2细胞单层模型研究MT1、MT2的吸收转运情况。方法:(1)多药耐药的构建:在半年时间里,通过低浓度梯度递增法,在培养液中添加紫杉醇(1 nM-200 nM),对紫杉醇敏感的HeLa细胞诱导成为对紫杉醇耐药的HeLa/Tax细胞;比较HeLa细胞以及HeLa/Tax细胞的生长趋势;采用Western blot法分别检测HeLa以及HeLa/Tax细胞中耐药相关蛋白P-gp、MRPl、MRP2、CYP3A4以及CYP2C8蛋白表达水平变化,分析细胞的耐药机制:通过磺酰罗丹明B(SRB)染色法测定P-gp/MRP2底物类抗癌药物紫杉醇、多西他赛和长春新碱对HeLa和HeLa/Tax细胞增值的半数抑制浓度(IC50),评价HeLa/Tax细胞的多药耐药特性(2)MT1和MT2对HeLa/Tax细胞多药耐药的逆转作用评价:分别测定紫杉醇、多西他赛、长春新碱单独或者联合一定浓度的MT1或MT2作用于HeLa/Tax细胞,对细胞增值的IC50值,根据IC50的下降倍数评价MT1和MT2对细胞多药耐药的逆转能力。(3)MT1和MT2逆转多药耐药的机制研究:Western blot法检测MT1、MT2单独给药或者联合给药对HeLa/Tax细胞中P-gp、MRP2蛋白表达水平的影响;采用MDR荧光检测试剂盒法研究MT1和MT2对HeLa/Tax细胞膜上P-gp转运泵活性的影响;利用构象敏感的抗-P-gp抗体的UIC2克隆和MC57克隆,研究HeLa/Tax细胞膜上的P-gp与MT1和MT2的作用方式;采用Caco-2细胞单层模型研究MT1和MT2吸收转运情况,分析其是否能够被P-gp转运。结果:(1)与HeLa细胞相比,HeLa/Tax细胞对紫杉醇、多西他赛、长春新碱的耐药指数分别为107.3、96、320.7。说明紫杉醇成功诱导细胞产生了多药耐药。(2)Western Blot显示,相对于亲本细胞HeLa来说,HeLa/Tax细胞中P-gp及MRP2明显高表达,而MRP1、CYP3A4、CYP2C8表达无变化。说明紫杉醇诱导的耐药和P-gp、MRP2过表达有关。(3)MT1和MT2在其对HeLa/Tax细胞无毒的浓度(5 μM、10μM)下,能逆转HeLa/Tax对紫杉醇、多西他赛、长春新碱的耐药;当紫杉醇联合MT1(5μM、10 μM)时,逆转倍数分别为9.6、12.4,而联合MT2(5 μM、10μM)时,逆转倍数为34.6、55.6;当多西他赛联合MT1(5 μM、10 μM)时,逆转倍数分别为5.4、12.1,而联合MT2(5 μM、10μM)时,逆转倍数为12.7、25;当长春新碱联合MT1(5 μM、10 μM)时,逆转倍数分别为5.1、7.7,而联合MT2(5 μM、10 μM)时,逆转倍数为31.4、53.7,可见MT2逆转紫杉醇、多西他赛、长春新碱在HeLa/Tax上耐药的效果强于MT1。(4)Western blot检测单独使用MT1、MT2(10 μM)或联合紫杉醇(50 nM)作用HeLa/Tax细胞24 h,可观察到细胞中P-gp和MRP2的表达量出现显著下降。(5)MT1(10、20、30 μM)以及 MT2(5、10 μM)作用 HeLa/Tax 细胞,能剂量依赖的抑制HeLa/Tax细胞对P-gp荧光底物的转运外排。(6)MT1及MT2作用HeLa/Tax细胞后,细胞膜上P-gp和UIC2抗体的结合能力下降,但和MC57抗体的结合能力增强,说明MT1、MT2与P-gp的作用模式是非底物样的。(7)在Caco-2细胞单层模型上,MT1、MT2表现为非外排的高渗透性化合物,说明其不具备P-gp底物特性。结论:紫杉醇诱导的HeLa细胞多药耐药和P-gp、MRP2过表达有关。在HeLa/Tax细胞模型上,MT1和MT2能有效逆转细胞对紫杉醇、多西他赛和长春新碱的耐药,且MT2比MT1效果显著。其部分机制包括抑制细胞内P-gp和MRP2的表达,抑制细胞膜上P-gp泵的转运功能。MT1以及MT2不是P-gp的转运底物,其对P-gp功能的抑制作用是通过非底物样作用模式。MT1和MT2是否抑制MRP2的转运功能尚未确定。