研究背景:肝脏移植历经了半个多世纪的发展,目前已成为治疗各种终末期肝病唯一的有效方法,并且可以极大地改善早期肝癌患者的预后。随着手术技术的逐渐完善,肝移植围术期死亡率仅为5%,术后1年生存率可达90%。肝脏缺血再灌注损伤（LIRI）是肝脏在遭受缺血损伤后重新获得血液灌注,反而加重功能障碍和结构损伤的现象。LIRI是肝移植术及肝脏部分切除术中常见的病理生理现象,是影响患者预后和术后死亡率的重要危险因素。探索LIRI的发生机制,对于减少供肝的保存损伤,提高边缘供肝的利用率,减少肝移植等待时间,改善肝移植术后患者预后有着重要的意义。Krüppel样因子10（KLF10）是一种转录调节因子,是TGF-β通路上的重要一环,可以在多种生理过程中发挥重要作用。研究证实,KLF10与氧化应激、自噬和缺血再灌注损伤有着千丝万缕的联系,且在多种肝脏疾病中发挥着重要作用,可以改善下肢和心肌缺血再灌注损伤。因此,KLF10可能是一个重要的LIRI的治疗靶点,但是尚未有研究证实KLF10在LIRI中的作用。自噬是一种细胞内细胞器和蛋白质自我消化的途径,线粒体的自噬参与了氧化应激和细胞死亡过程的调节,其中PINK1/Parkin通路是线粒体自噬的主要途径。目前,已有研究证实线粒体自噬可以通过调控线粒体自噬途径减少活性氧（ROS）的产生,并减少细胞凋亡,减轻LIRI。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞内氧稳态的关键因子,与β亚基共同激活下游基因的转录。在LIRI中,ROS激活的氧化应激发挥了主导作用。研究表明,氧化应激反应中,ROS可以上调HIF-1α的水平,HIF-1α可以通过线粒体途径减少ROS的产生,并通过增加线粒体自噬减轻LIRI。但是其具体的分子生物学机制仍不清楚。研究目的:1.探究LIRI的影响因素。2.明确KLF10在LIRI时调控氧化应激介导的线粒体自噬和细胞凋亡的分子机制。3.探讨KLF10作为预防或治疗LIRI的靶点进行的临床转化的可能性及意义。研究方法:1.生物信息学分析:使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的基因表达综合数据库（GEO）中肝缺血再灌注数据集GSE14951和KLF10过表达的原代肝细胞数据集GSE197054对差异基因进行筛选,并使用基因本体（GO）、基因集富集分析（GSEA）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）等生物信息学工具对信号通路进行富集分析。2.细胞LIRI模型构建:使用MIHA和LO-2正常肝细胞系通过可变控氧细胞培养箱构建细胞缺血再灌注模型,缺血时间分别选取0小时、6小时、12小时和24小时,再灌注时间选取0小时、2小时、6小时和12小时。之后通过慢病毒转染的方法,改变KLF10、Parkin、HIF-1α的表达水平以探究基因的功能和分子机制;通过GFP-mRFP-LC3腺病毒的转染进行自噬通量的检测。3.动物LIRI模型构建:使用SD大鼠构建大鼠肝移植模型,C57BL/6小鼠构建小鼠肝脏缺血再灌注模型。大鼠肝移植模型分别在灌注前、灌注后、关腹前、门脉开放后、关腹前、术后3天、术后7天获取样本;小鼠肝脏缺血再灌注模型,则将缺血时间固定为1小时,再灌注时间分别选取0小时、6小时、12小时和24小时进行实验,并使用AAV8腺相关病毒通过尾静脉注射的方法对小鼠的肝细胞进行KLF10基因表达的干扰。4.临床样本的收集及分析:纳入2020年1月到2021年1月在青岛大学附属医院进行器官捐献和肝脏移植的患者。首先统计分析了一般临床资料,之后对器官捐献者的供肝进行采样,分别选择灌注前、灌注后10分钟、门脉开放后30分钟、动脉开放后30分钟、关腹前进行取样,并对对应的肝移植受体术前1天和术后48小时的肝脏功能进行分析。5.样本处理:1)基因表达水平的改变。通过慢病毒和腺相关病毒的转染,对MIHA、LO-2细胞和C57小鼠的KLF10、Parkin、HIF-1α的表达量进行改变;通过对MIHA细胞进行Baf A1的处理和mRFP-GFP-LC3腺病毒的转染,探究自噬流的变化;2)基因表达水平的检测。通过蛋白免疫印记法、实时荧光定量PCR的方法,对样本的KLF10、LC3、Parkin、PINK1、COXⅣ、P62的表达水平进行检测,评估自噬通量的变化;检测Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达水平,探究细胞凋亡的变化情况;3)细胞凋亡和损伤的检测。使用流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI染色法对缺血再灌注过程中的细胞凋亡率进行检测;通过ELISA对ALT和AST检测验证细胞的损伤程度;4)细胞成像。通过双标腺病毒转染,使用电子显微镜、共聚焦显微镜对细胞的自噬水平进行检测;通过TUNEL染色、HE染色的方法使用荧光显微镜对细胞的损伤、凋亡进行检测;5)染色质蛋白质互作的检测。使用ChIP-PCR、双荧光素酶报告基因实验对HIF-1α、KLF10、Parkin的基因表达关系进行论证。结果:1.KLF10在肝缺血再灌注过程中表达升高:GEO差异基因分析显示,缺血再灌注后KLF10的表达显著升高,并与线粒体自噬和凋亡存在潜在联系;使用已构建成功的细胞、动物和捐献者样本通过Western Blotting和qRT-PCR验证了这一结果。HE染色表明,缺血再灌注过程中肝脏损伤逐步加重。2.在肝脏缺血再灌注的过程中线粒体自噬和细胞凋亡增加:GO和GSEA富集分析显示,细胞凋亡和损伤的通路在肝脏缺血再灌注过程中被显著富集;在细胞、动物和捐献者的肝缺血再灌注样本中通过Western Blotting,mRFP-GFP-LC3双标腺病毒和Baf A1处理均显示细胞线粒体自噬通量的增加,并使用电子显微镜验证了这一结果;Annexin V-FITC与PI的流式细胞仪检测以及TUNEL检测均显示细胞的凋亡数目增加;细胞培养基、动物和捐献者的外周血通过ELISA法检测ALT浓度,结果显示肝细胞损伤程度加重。3.KLF10增加了肝缺血再灌注中的线粒体自噬,减少了凋亡与肝脏的损伤:GO、KEGG、GSEA分析表明KLF10与线粒体自噬、氧化应激、细胞凋亡和损伤相关;在KLF10表达干扰后的肝细胞缺血再灌注模型中,通过Western Blotting实验、mRFP-GFP-LC3双标腺病毒实验、Baf A1自噬抑制实验、流式细胞术、TUNEL实验、ELISA实验等验证了细胞的自噬通量减少,但细胞凋亡和肝细胞的损伤增加;KLF10过表达慢病毒与之结果相反。4.PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通过减少细胞凋亡减轻肝缺血再灌注损伤:将MIHA和L-O2细胞系的Parkin过表达并进行实验验证,实验结果显示缺血再灌注过程中线粒体自噬增加,凋亡和肝细胞的损伤减少。5.KLF10介导的线粒体自噬通过减少凋亡减轻肝缺血再灌注损伤:将MIHA细胞同时导入KLF10-shRNA慢病毒和Parkin过表达慢病毒进行回复实验,结果表明KLF10干扰后发生的线粒体自噬减少、凋亡和细胞损伤的增加均可以被Parkin过表达回复。6.KLF10通过结合Parkin的启动子激活线粒体自噬:GO富集分析显示,转录因子在肝缺血再灌注损伤过程中起到了关键作用;ChIP实验显示,KLF10能够结合Parkin的启动子;双荧光素报告基因实验显示,KLF10可以激活Parkin启动子下游的转录。7.氧化应激状态下HIF-1α通过直接激活KLF10的表达增加线粒体自噬并减少凋亡减轻肝缺血再灌注损伤:GO和GSEA分析显示HIF-1α相关的缺氧和氧化应激通路被显著富集;通过KLF10-shRNA慢病毒和HIF-1α过表达慢病毒进行回复实验,证实HIF-1α通过KLF10介导线粒体自噬减少细胞凋亡。然后通过ChIP和双荧光素报告基因实验验证HIF-1α可以直接激活KLF10的表达。8.KLF10的敲低减少小鼠肝缺血再灌注中的线粒体自噬并加重肝功能的损伤:通过AAV8腺相关病毒干扰小鼠肝脏KLF10的表达后构建小鼠肝缺血再灌注模型,通过Western Blotting实验、电子显微镜、HE染色、ELISA实验等证实了在体内实验中自噬通量减少,但细胞凋亡和细胞损伤增加。9.KLF10的高表达加速肝移植术后肝功能的恢复:肝移植术后48小时患者外周血的ALT、AST的浓度和关腹前KLF10的mRNA相对表达量均呈负相关。结论:1.KLF10通过结合Parkin的启动子启动Parkin的表达直接激活线粒体自噬来减少细胞凋亡,从而缓解LIRI,为LIRI的干预提供了新靶点。2.氧化应激状态下,HIF-1α通过结合KLF10的启动子启动KLF10的转录,通过HIF-1α/KLF10/Parkin轴介导线粒体自噬减少细胞凋亡,从而减轻LIRI,阐明了在LIRI过程中氧化应激介导线粒体自噬发挥保护作用的机制,为LIRI的治疗指明了方向。3.KLF10的敲低可以减少小鼠肝缺血再灌注中的线粒体自噬并加重肝功能的损伤,证实KLF10具有临床转化价值。4.KLF10的高表达可以加速肝移植术后肝功能的恢复,具有临床应用前景。