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ras基因是一种重要的癌基因,其命名来自大鼠肉瘤的英文ratsarcoma。Ras基因家族包括三个成员,即K-ras、H-ras和N-ras,分别定位于第12、11和1号染色体,编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质,即p21ras蛋白,三种p21ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性。p21ras蛋白作为信号传递蛋白,调节细胞的分化增殖,在正常情况下只有短暂的信号传递作用,但是当Ras基因发生突变或过度表达时,细胞增殖不受控制,导致细胞恶性转化。人们在多种肿瘤中检测到p21ras蛋白的高表达,提示p21ras蛋白的高表达确与肿瘤的形成以及发生和发展存在密切关系,因此,我们提出了假设,利用细胞内抗体技术研制细胞内抗体,通过抗原抗体的结合,使p21ras蛋白失去与GTP结合的能力,从而达到治疗肿瘤的目的。本研究通过p21ras原核表达质粒的构建和蛋白诱导表达,为细胞内抗体的制备提供抗原,并通过多克隆抗体的制备证实其免疫活性。本研究通过逆转录的方法和全基因合成技术获得K-ras、H-ras和N-ras基因,并在其两端设计限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点,双酶切ras基因和PET-28a(+)空质粒,利用T4连接酶连接后,克隆到表达质粒PET-28a(+)中,经酶切和测序表明构建的重组质粒与理论设计一致。将三个重组质粒转化到细菌BL21后,卡那霉素筛选,IPTG诱导,分泌表达p21ras蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,三个p21ras蛋白在BL21中均获得了高效表达,表观分子量为23KD,Westernblot分析表明表达产物能够与抗p21ras蛋白抗体特异结合。蛋白以包涵体形式存在,包涵体经镍离子亲和纯化柱纯化得到纯度95%以上的p21ras蛋白。将纯化的p21ras蛋白免疫新西兰大白兔,每个p21ras蛋白各免疫2只,免疫前采取2ml空白血清作为阴性对照,0、2、4、6周各免疫一次,第一次免疫后每隔两周,耳缘静脉采血收集血清,Western blot分析证实免疫血清中p21ras多克隆抗体抗体的产生和p21ras蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体水平。结果发现,第一次免疫后2周出现抗p21ras蛋白抗体,6周时抗体水平达到最高。本实验成功完成了K-ras、H-ras和N-ras三个基因的原核表达质粒的构建、表达和纯化以及其免疫原性,并通过免疫兔制备出p21ras蛋白的多克隆抗体,为研究p21ras蛋白的性质和功能以及下一阶段的实验研究提供了科学基础。