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小干扰RNA (siRNA)能够沉默疾病相关基因的表达,但是如何有效地运输这些高负电荷的分子仍具有挑战性。寻找和开发无毒且高效的siRNA递送方法来实现特定的基因沉默一直是研究热点。天然脂蛋白(低密度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL)是内源性的纳米颗粒,作为药物载体已具有悠久的历史,而人工模拟脂蛋白是一种新型的、具有临床应用潜力的纳米载体。本文建立和发展了以LDL和仿HDL纳米颗粒为载体的siRNA递送方法,解决了siRNA的靶向运输和胞浆释放等问题,取得了以下研究结果’：(1)使用纯化的LDL纳米颗粒成功地实现了功能性siRNA的靶向递送。当siRNA共价耦联到胆固醇后,每分子的LDL上可装载超过25分子的胆固醇-siRNA (chol-siRNA),形成的复合纳米颗粒LDL-chol-siRNAs保持了LDL的形态、结构和功能。实验结果表明,LDL-chol-siRNAs能够经由LDL受体介导的内吞途径选择性地被细胞摄取,其基因抑制效率是单独使用chol-siRNA的2.1倍。然而,此方法有一定的局限性,因为受体介导的内吞途径使得LDL-chol-siRNAs主要蓄积在内体/溶酶体中,若能解决siRNA的胞浆释放问题,将有望获得更好的基因沉默效果。(2)提出采用光化学内化(PCI)法促进LDL运载药物的胞浆释放,发现PCI法对LDL表面装载的药物具有最佳的胞浆释放效果。我们使用三种不同类型的荧光染料以模拟化疗药物,通过不同的方法分别装载到LDL中,包括插入到磷脂单分子层外膜(表面装载),耦联到apoB-100蛋白的特定氨基酸上(蛋白标记法),重组进入LDL的脂质核心(核心装载)。荧光显微成像结果显示,这些载药的LDL纳米颗粒均是通过LDL受体介导的内吞机制进入人肺癌细胞A549中的。当联合使用PCI法后,通过比较光照前后细胞内荧光信号变化的倍数,显示出不同装载类型药物的胞浆释放程度：LDL表面装载的染料DiI释放量最大,脂蛋白耦联标记的染料FITC释放程度次之,核心装载的染料Fluo-BOA胞浆释放效果不佳。此结果表明,PCI法诱导的LDL装载药物的胞浆释放,与LDL的载药方式密切相关,因而尤其适应用于解决LDL表面装载chol-siRNA的胞浆释放问题。引入PCI法后,LDL-chol-siRNA的基因沉默效果随着光照的时间增加而提高,到最大光照时问为180 s时,基因抑制效率从38%提高到78%。(3)利用HPPS (仿HDL纳米载体)靶向清道夫B类I型受体(SRB1)的机制,建立了一种新的纳米载药方法能将siRNA直接运输到细胞胞浆中。实验结果显示,每分子HPPS可有效地装载8分子的chol-si-bcl-2(胆固醇修饰的siRNA靶向bcl-2),形成的HPPS-chol-si-bcl-2纳米颗粒保持了良好的结构完整性和纳米颗粒的均一性,对SRB1高表达的细胞具有明显的Bcl-2蛋白表达抑制效果,而对SRB1低表达的细胞无此功能。通过荧光共聚焦成像和亚细胞碎片分离技术进一步证实,HPPS-chol-si-bcl-2在胞内的摄取涉及到一种直接的胞浆转运机制。与单独的chol-si-bcl-2相比,HPPS-chol-si-bcl-2在Bcl-2蛋白表达的抑制和促凋亡方面分别有4.8倍和2.5倍的增加。直接的胞浆释放机制和良好的生物相容性使得HPPS尤其适合于递送胞内活性的基因干扰药物。(4)成功地将靶向分子表皮生长因子(EGF)耦联到HPPS上,使得HPPS的靶向性由SRB1转换为EGF受体,拓展了HPPS在肿瘤靶向诊疗中的应用范围。建立了评价纳米颗粒靶向性的双色荧光标记方法,双色荧光成像证实装载有近红外荧光染料DIR-BOA的EGF-HPPS能够被高表达绿色荧光蛋白(GFP)-EGFR的细胞特异地识别与摄取,而不表达GFP-EGFR的细胞则无DiR-BOA荧光信号。本研究利用脂蛋白和人工模拟脂蛋白作为siRNA的递送载体,分别采用PCI法和SRB1特异性运输机制等手段,有效地解决了LDL和HPPS运载siRNA过程中的胞浆释放问题,为加速脂蛋白纳米载体成为高效的siRNA运输平台提供了技术支撑,同时也为肿瘤的靶向基因治疗带来了新的机遇。采用双色荧光成像的方法证实和鉴定了EGF-HPPS的特异靶向性,拓展了HPPS在肿瘤渗疗中的应用范围,也为分析协同靶向与目标靶向间的相互作用关系提供了实验方法。