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人口、资源、环境问题是严重影响新世纪人类生存和经济社会发展的关键问题。重点研发安全有效避孕节育新技术和药物,是控制人口数量、提高人口质量所亟待解决的重大科学问题。通常人们认为避孕是女性的责任,但随着女性社会分工及社会地位的提高,人口控制更需要男性发挥积极的作用。然而,男性避孕药物的研发仍无突破性进展,面临着“可靠方法不可逆,可逆方法不可靠”的尴尬局面。众所周知,睾丸产生的精子是不成熟精子,缺乏运动和受精能力。附睾是精子成熟的场所,精子表面存在的大量蛋白必须在附睾中进一步修饰、折叠,发生必要的结构变化,才能使精子适应女性生殖道内复杂的生理变化,获得运动和受精能力,达到功能上的成熟。某些精子表面蛋白的功能缺陷将会影响精子的正常成熟和获能过程,导致男性不育。在研究免疫机制造成的不孕不育过程中,人们已经注意到很多患者体内存在抗精子抗体,提示人们可以通过开发精子膜抗原疫苗达到免疫避孕目的。附睾蛋白酶抑制剂(Epididymal protease inhibitor,Eppin)基因于2001年由美国O’Rand教授首次在人类发现。2004年,The Science首次报道利用Eppin蛋白免疫猕猴,发现随着免疫次数的增加,78%的猕猴血清中产生了高滴度的Eppin抗体,精子动力显著下降,精液粘稠度下降,最终达到可逆性避孕。O’Rand教授认为血清中Eppin抗体的高低决定了精浆中抗体滴度的高低,而精浆中Eppin抗体滴度的高低决定了动物免疫避孕的效果。文献报道,Eppin抗体影响精液凝固机制,从而影响精子动力,动物最终表现为不育。本实验室体外重组人Eppin蛋白,多次免疫雄性猕猴,猕猴精子动力下降,表现为不育。但动物并未出现精液凝固障碍。因此,本课题组猜想,Eppin抗体是否会通过其他机制影响精子动力?并且,Eppin抗体会否对睾丸支持细胞功能产生影响?迄今为止,未有报道指出Eppin的两种同分异构体在亚细胞定位和功能上的差异。而明确亚细胞定位往往提示了蛋白的合成途径以及定位,同时可以提示蛋白的功能,有助于我们评价Eppin蛋白在男性生殖系统中的生理作用。针对这些问题,我们开展了以下两部分实验：第一部分：Eppin抗体降低睾丸支持细胞膜阻抗及相关机制的研究(1)在transwell小室内接种原代支持(sertoli)细胞,待形成紧密连接(tight junctions, TJs)后于不同时间点测定sertoli细胞膜阻抗值；(2)磷酸化抗体免疫沉淀,观察在Eppin抗体加入前后occludin、claudin-11、E-Cadherin、F-actin、ZO-1酪氨酸残基和丝氨酸残基磷酸化状态；并通过免疫沉淀观察各蛋白组分间相互作用的变化；(3)免疫荧光鉴定occludin与claudin-11定位的改变。通过上述实验可知,Eppin抗体增加E-Cadherin酪氨酸残基磷酸化,减弱E-Cadherin间相互作用,从而改变sertoli细胞间粘附。同时Eppin抗体增加occludin与claudin-11酪氨酸残基磷酸化,减弱occludin与claudin-11间相互作用,减弱claudin-11间相互作用,降低细胞膜阻抗。第二部分：Eppin同分异构体亚细胞定位及其在精子动力中生理作用的研究(1)构建pEGFP-C1与Eppin1/3、pEGFP-C1与Eppin2、pEGFP-C1与WAP保守区、pEGFP-C1与Kunitz保守区融合蛋白,亚细胞定位实验结果发现Eppin1/3和Eppin2都定位于高尔基体,WAP保守区全细胞定位,而Kunitz保守区则定位于核周；(2)BFA干扰后观察Eppin1/3与Eppin2的亚细胞定位,发现Eppin1/3定位于内质网,Eppin2全细胞定位；根据上述结果行免疫电镜实验发现,Eppin2具有内循环蛋白定位特点,定位于内质网-高尔基体间结构；(3)由文献可知,内循环蛋白往往和细胞骨架蛋白相互作用,在细胞内运动。因此,构建pHcRedN1/1与TUBB3 (beta-tubulin亚单位之一)融合蛋白,与pEGFP-Eppin1/3或pEGFP-Eppin2共转染后,观察两蛋白共定位情况。结果发现,Eppin(无论是Eppin1/3或Eppin2)确实与TUBB3共定位,结合免疫沉淀实验证明Eppin(无论是Eppin 1/3或Eppin2)与TUBB3发生相互作用,并且这种相互作用不受钙离子浓度的影响；(4)提取精子线粒体膜蛋白,Westernblot发现Eppin与TUBB3都定位于线粒体膜。但遗憾的是,由于抗体限制,无法区分是Eppin1/3还是Eppin2定位于线粒体膜。使用不同化合物处理精子后提取线粒体膜蛋白,免疫沉淀后发现TUBB3是线粒体膜蛋白,而Eppin通过与TUBB3间形成二硫键定位于线粒体膜；(5) Eppin抗体与精子共孵育后,精子线粒体膜电位显著下降,ATP产生减少,精子动力显著被抑制；透射电镜显示,线粒体组成的正常环状结构被破坏,且SMR也部分消失。由上述结果可知,Eppin(无论是Eppin1/3或Eppin2)可与骨架蛋白—TUBB3,相互作用,并且通过蛋白间相互作用定位于线粒体膜上。但由于Eppin抗体的限制,我们无法鉴别具体是哪种同分异构体定位于线粒体膜上。Eppin在线粒体膜上通过二硫键交联,连接相邻线粒体,维持精子线粒体正常的环状结构。而Eppin抗体通过封闭这种交联作用从而破坏精子线粒体稳定结构,线粒体膜电位下降,ATP生成减少,精子动力显著下降。综上所述,本研究为血清中Eppin抗体如何通过血睾屏障进入精浆提出了合理解释。并同时揭示了Eppin在维持精子动力中的重要作用,完善了Eppin蛋白引起免疫避孕的机制研究。