睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究　　 研究背景　　 Leydig细胞(LCs)是男性体内睾酮的主要来源，Leydig细胞发育异常，功能不全或数量异常，在青春期将影响男性第二性征的形成，在性成熟期会出现雄激素缺乏性疾病，导致机体出现成分改变，肌肉力量和躯体功能下降，性功能、生殖功能降低，情绪低落以及认知能力的减退[1]。引起该类疾病的病因也趋向多样化，如因创伤、肿瘤等造成的睾丸缺失，先天性疾病，环境污染，工作压力日益加剧和人口老龄化等原因，使得近年来雄激素缺乏性疾病的发病率具有逐年上升的趋势[2, 3]。针对这类疾病，目前尚无满意的治疗措施，最常用的治疗方法是补充外源性雄激素，但其临床应用较为困难，补充的量及时间难以掌握，无法符合机体的生物节律，且长期应用后存在较多的并发症[1,4]。　　 随着组织工程技术的不断进步，以组织工程技术构建雄激素分泌组织，有望成为一种理想的治疗手段[5-7]。本课题组前期研究证实了Leydig细胞构建雄性激素分泌组织的可行性，但研究发现成熟LCs不能增殖，存活时间短，构建组织无法长期维持功能[8, 9]。同其它功能分化细胞一样，睾丸Leydig细胞也来源于原始未分化的Leydig干细胞，睾丸内Leydig细胞通过Leydig干细胞（Leydig Stem Cells，SLCs）的增殖、分化维持群体数目的动态稳定[10, 11]。由于Leydig干细胞具有雄性激素分泌潜能和自我更新能力，而且有可能在植入后受到机体先天调控机制的影响，从而更符合生理要求，因此成为最有前景的雄激素分泌组织构建的种子细胞。长期以来SLCs由于缺乏特异性的标志物而阻碍了其分离及纯化。此外，由于睾丸内细胞成分较多，且存在复杂的细胞通信，研究证实通过各种方法所获得的含SLCs的Leydig细胞群，其中的干细胞很快就发生分化，难以维持干性，因而无法获得大量SLCs。近年来，SLCs得到确认及鉴定并有分离纯化的报道[12]，但由于采用传统的Percoll分离法及免疫粘附法，SLCs的流失量及损伤较大，难以满足做为组织工程种子细胞的需求，此外SLCs在体外的培养特性，培养方法，增殖能力，干性维持能力及睾酮分泌能力均缺乏详细的研究。研究目的　　 本研究拟通过胶原酶消化、差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法，改进Leydig干细胞的分离及纯化方法。由7天大鼠睾丸内获取纯化的Leydig干细胞，进一步研究在体外条件下SLCs的培养特性，包括在条件培养液中的增殖能力及干性维持能力。通过对表面标志物及产生睾酮关键酶的测定，并经定向诱导分Leydig细胞系鉴定Leydig干细胞，同时检测分化后Leydig细胞的睾酮分泌能力，从而初步解决组织工程化雄激素分泌组织研究中种子细胞的问题。　　 研究方法　　 一.　　 差速贴壁法分离大鼠Leydig细胞群：获取生后7天龄雄性Wistar大鼠双侧睾丸，4℃无菌条件下去除白膜及较大的血管，用胶原酶震荡消化和400目（Ф33μm）不锈钢滤网过滤，离心后贴壁培养2小时，然后弃上清并漂洗1次，获得Leydig细胞群。　　 二　　 ． 双抗体免疫磁珠分选法获取纯化的SLCs：将贴壁分离法获得的细胞计数、离心，然后重新悬浮，4℃条件下加入LHR抗体孵育30分钟后，离心去除上清后悬浮细胞，加入免疫磁珠放置15分钟，上机经自动磁性活化细胞分选(MACS)获取阴选细胞。所获得的阴选细胞重复上述步骤，加入PDGFRα抗体和免疫磁珠分别孵育30分钟及15分钟，再次经MACS获取阳选细胞，由此得到纯化的PDGFRα(+)/LHR(-)细胞。　　 三.　　 条件培养体系对SLCs增殖及干性维持作用：纯化的细胞获取后以条件培养体系进行培养，观察细胞形态改变及培养特性，采用CCK(Cell Counting Kit)法测定其增殖能力并绘制增殖曲线。对培养一个月后的细胞进行3β-HSD免疫组织化学染色及流式细胞分析，观察其干性维持能力。　　 四.　　 SLCs表面标志物及酶的检测：对Lyedig细胞系细胞标志物PDGFRα，干细胞标志物LIFR， Leydig细胞分化的特异性酶3β-HSD进行免疫组织化学染色及流式细胞分析以鉴定SLCs。　　 五　　 ． SLCs的诱导分化及睾酮分泌潜能的检测：将SLCs分两组按照1.0×105/ well密度接种于24孔板上，其中一组在条件培养液中加入T3， HCG对SLCs进行诱导分化，隔日收集诱导分化组和未诱导组培养液上清，经 Access 全自动免疫分析系统（RIA，放射免疫测定）测定睾酮水平，观察其分化能力及睾酮分泌潜能。　　 研究结果研究目的　　 本研究拟通过胶原酶消化、差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法，改进Leydig干细胞的分离及纯化方法。由7天大鼠睾丸内获取纯化的Leydig干细胞，进一步研究在体外条件下SLCs的培养特性，包括在条件培养液中的增殖能力及干性维持能力。通过对表面标志物及产生睾酮关键酶的测定，并经定向诱导分Leydig细胞系鉴定Leydig干细胞，同时检测分化后Leydig细胞的睾酮分泌能力，从而初步解决组织工程化雄激素分泌组织研究中种子细胞的问题。　　 研究方法　　 一.　　 差速贴壁法分离大鼠Leydig细胞群：获取生后7天龄雄性Wistar大鼠双侧睾丸，4℃无菌条件下去除白膜及较大的血管，用胶原酶震荡消化和400目（Ф33μm）不锈钢滤网过滤，离心后贴壁培养2小时，然后弃上清并漂洗1次，获得Leydig细胞群。　　 二　　 ． 双抗体免疫磁珠分选法获取纯化的SLCs：将贴壁分离法获得的细胞计数、离心，然后重新悬浮，4℃条件下加入LHR抗体孵育30分钟后，离心去除上清后悬浮细胞，加入免疫磁珠放置15分钟，上机经自动磁性活化细胞分选(MACS)获取阴选细胞。所获得的阴选细胞重复上述步骤，加入PDGFRα抗体和免疫磁珠分别孵育30分钟及15分钟，再次经MACS获取阳选细胞，由此得到纯化的PDGFRα(+)/LHR(-)细胞。　　 三.　　 条件培养体系对SLCs增殖及干性维持作用：纯化的细胞获取后以条件培养体系进行培养，观察细胞形态改变及培养特性，采用CCK(Cell Counting Kit)法测定其增殖能力并绘制增殖曲线。对培养一个月后的细胞进行3β-HSD免疫组织化学染色及流式细胞分析，观察其干性维持能力。　　 四.　　 SLCs表面标志物及酶的检测：对Lyedig细胞系细胞标志物PDGFRα，干细胞标志物LIFR， Leydig细胞分化的特异性酶3β-HSD进行免疫组织化学染色及流式细胞分析以鉴定SLCs。　　 五　　 ． SLCs的诱导分化及睾酮分泌潜能的检测：将SLCs分两组按照1.0×105/ well密度接种于24孔板上，其中一组在条件培养液中加入T3， HCG对SLCs进行诱导分化，隔日收集诱导分化组和未诱导组培养液上清，经 Access 全自动免疫分析系统（RIA，放射免疫测定）测定睾酮水平，观察其分化能力及睾酮分泌潜能。　　 研究结论　　 本研究证实由差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法能获得纯化的PDGFRα(+)/LHR(-)阴性细胞，该细胞能够在条件培养液中增殖，并在体外培养一个月后维持未分化状态，此外，经各种标志物检测证实Leydig细胞标志物PDGFRα(+)，干细胞标志物LIFR(+)，Leydig细胞分化的特异性酶3β-HSD为阴性，经诱导分化后细胞具有睾酮分泌能力并表现为3β-HSD(+)。由此证实细胞符合SLCs所必需具有的特征：1、在体外能自我更新 2、能维持未分化状态 3、具有向Leydig细胞系分化及睾酮分泌潜能。研究结果表明采用该方法获取SLCs，操作简便，细胞损伤小并且获取纯度高。SLCs体外增殖培养初步解决了构建组织工程化雄激素分泌组织种子细胞问题。