研究背景及目的：结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是较常见的消化道恶性肿瘤,据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)报道,其发病率居恶性肿瘤第3位,仅次于肺癌和乳腺癌,死亡率居恶性肿瘤第5位。流行病学研究发现,结直肠癌的发病率和死亡率在我国仍有上升的趋势。结直肠癌的产生的原因有环境因素和遗传因素,临床治疗中有一半以上的结直肠癌患者在治疗前已出现了肝脏转移,手术后复发的患者中也有50%发生肝转移,对于肝转移目前的主要治疗方式是手术切除；Ⅱ期-Ⅲ期的结直肠癌手术治疗也会发生局部区域复发,其中全直肠系膜切除术(totalmesorectalexcision, TME)治疗Ⅲ期患者后局部复发率也高达20～30%。为提高局部控制率、远期生存率和患者的生活质量,这部分患者应该同时进行标准的结直肠癌辅助治疗。放射治疗是肿瘤治疗和辅助治疗的重要常用手段之一,在临床治疗中被广泛应用于结直肠癌,但放疗过程中存在着一系列的副作用、并发症、辐射抵抗等,这些也是患者治疗失败的主要原因,这是因为个体之间的差异,不同的个体对放射治疗展示出的不同的效果。其中辐射抵抗导致治疗没有明显反应,还有可能错过肿瘤治疗的最佳时期。辐射抵抗的产生是一个多种因子和基因相互作用的复杂机制,其发生的主要原因是细胞的辐射敏感性降低,而细胞周期的阻滞、细胞凋亡的异常、肿瘤微环境的变化等多种因素都能使细胞的辐射敏感性降低。因此,在结直肠癌的放射治疗医学研究中,辐射抵抗是一个具有挑战性的课题。许多研究者尝试找到有关结直肠癌辐射敏感性的标志分子如P53和EGFR等更好的对病人进行甄别分类,实现个性化治疗。阐明辐射敏感性的分子机制,其中的一些分子可能有助于解决这一难题,使结直肠癌的治疗向精准和个性化发展。MicroRNAs (miRNAs)是由基因组编码的参与基因转录后水平调控的一类长为20-24nt的非编码的小分子RNA,它们能通过碱基互补配对与靶基因mRNA序列的3’非翻译区或编码区结合,调控基因的表达。miRNA在多种生命活动中发挥着作用,如发育的时空决定、细胞的增殖和死亡等,后来发现其和肿瘤的发生也有密切的关系。一些研究表明,miRNA能够引起肿瘤辐射敏感性变化,与肿瘤的辐射抵抗的产生密切相关。miR-124是一个与多种恶性肿瘤密切相关的miRNA,如肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质细胞瘤等,在肿瘤发生过程中起着重要作用。miR-124最早在小鼠的大脑中被提取出来,它可作用于叉头框蛋白Q1(forkhead box Q1, FOXQ1), CDK4 (cyclin-dependentkinase4, CDK4)、 CDK6等,然而目前miR-124的辐射抵抗原理几乎未见报道。本研究拟探讨miR-124在结直肠癌变前后的表达变化以及与结直肠癌细胞辐射敏感性的关系,并进一步探讨其发挥作用的可能分子机制。本文研究发现miR-124在结直肠癌细胞和组织中表达均降低,过表达miR-124能增强结直肠癌细胞辐射敏感性。通过生物信息学发现PRRX1是miR-124下游直接调控的靶基因,敲除PRRX1能增强结直肠细胞辐射敏感性,但过表达PRRX1可以逆转miR-124对结直肠癌细胞辐射敏感性增强的效应。本研究为miR-124在结直肠癌细胞辐射敏感性中的分子机制提供了新的见解,为临床结直肠癌的治疗靶点提供新的理论依据,为解决放射治疗中辐射抵抗问题提供新的思路和理论基础。方法：1.结直肠癌细胞和癌旁组织中miR-124表达检测人结直肠癌细胞系SW480、LOVO、SW620、HCT-116、HT-29、LST-174和人正常结直肠粘膜细胞FHC均购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。全部人结直肠癌组织样本均取自南方医科大学南方医院2010年至2014年普通外科手术标本,对照组取至少离肿瘤至少5cm以上的正常结直肠组织,所有样本均未接受过放疗、化疗和其他抗肿瘤治疗,最终由病理判断确诊为结直肠癌。采用TRIZOL法裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀的方法提取结直肠癌细胞和组织标本总RNA。按照Thermo Fisher Scientific逆转录试剂盒说明书操作,逆转录合成cDNA后,用实时定量PCR实时检测miR-124在不同的结直肠癌细胞和组织中表达水平的变化,再进行统计分析。2.细胞辐射敏感性的检测2.1.建立稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞株LV-miR-124和LV-con’慢病毒上清分别转染细胞系SW480、LOVO,随后采用流式细胞仪分选GFP+细胞,得到稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞系。2.2.过表达miR-124不同剂量辐射下细胞存活分数取处于对数生长期的未处理和稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞系SW480、LOVO接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别给予0、2、4、6、8、10 Gy的X线照射(用Varian 600C加速器6MV-X线,SSD为100 cm)。每个剂量点设3个平行重复样本,照射后常规培养2周后,用4%多聚甲醛固定、吉姆萨染色。将低倍显微镜下计算出各种细胞的克隆数(细胞数>50个为1个有效克隆),采用GraphPadPrism5.0软件进行“多靶单击模型(Multitarget-single hitting)’’拟合细胞存活曲线,获得D0、Dq、SF2等放射敏感参数。2.3.过表达miR-124的细胞系不同剂量辐射下凋亡相关蛋白的检测取对数生长期的未处理和稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞系SW480、LOVO细胞,辐射后6h提取细胞总蛋白,Western blot检测上述细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、 caspase-3和磷酸化的γ-H2AX的变化。3.miR-124调控结直肠癌细胞辐射敏感性的分子机制3.1生物信息学预测miR-124下游调控靶基因利用生物信息学预测软件targetscanhuman6.0 (http://www.targetscan.org/)和常用miRNA数据库TargetScan和Pictar对miR-124的靶基因进行预测分析,按照软件操作流程预测miR-124下游调控的靶基因,并通过文献筛选,最终选定PRRX1作为下一步研究的目标。3.2荧光素酶报告系统验证PRRX1是miR-124的靶基因构建miR-124预测结合位点的PRRX1基因3’非编码区(3’UTR)以及突变型PRRX1的3’非编码区的荧光素酶报告质粒,获得pLUC-3’UTR-PRRX1以及pLUC-3’UTR-mut-PRRX1荧光素报告质粒,用于后面的共转染和荧光素酶报告基因检测,将pLUC-3’UTR-PRRX1以及pLUC-3’UTR-mut-PRRX 1荧光素报告质粒和miR-124mimics及inhibitors共转染,采用Promega公司Dual-Luc iferase报告基因检测系统进行荧光素酶活性检测,所有实验重复3次和统计学分析。3.3干扰PRRX1对结直肠癌细胞辐射敏感性LV-PRRX1和对照LV-shcon慢病毒悬液分别感染结直肠癌细胞,随后通过流式细胞仪分选GFP+细胞,得到稳定干扰PRRX1的细胞。将细胞分不同剂量进行照射,计算克隆形成率和分析存活分数,运用GraphPad Prism 5.0软件进行“多靶单击模型(Multitarget-single hitting) "曲线拟合分析。3.4过表达PRRX1可以逆转miR-124对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响依据阳离子脂质体法将pCDNA3.1-PRXX1质粒转染至已构建的稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞中。48h后Western blot检测转染效率,将细胞分不同剂量不同组进行照射,克隆形成实验反应细胞辐射敏感性的变化。克隆形成率以及存活分数运用GraphPad Prism 5.0软件进行“多靶单击模型”曲线拟合,并且Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3和磷酸化的γ-H2AX的变化。3.5动物实验在体内环境下观察miR-124对结直肠癌辐射敏感性的影响。取出的肿瘤组织并测量大小,绘制辐射条件下肿瘤体积生长曲线,统计分析。4.统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,两样本平均数的比较用独立样本的t检验,两组以上样本平均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验采用Levene’s Test P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.miR-124在结直肠癌细胞和组织中表达降低荧光定量PCR结果显示：miR-124在结直肠癌细胞株中表达下降,与邻近正常结直肠标本相比,miR-124在癌组织样本中表达明显降低。2.过表达miR-124能增强结直肠癌细胞辐射敏感性2.1.过表达miR-124在不同剂量辐射下细胞存活分数克隆形成实验结果证实：与对照组相比,过表达miR-124在辐射时(不同剂量下)可以降低细胞存活分数,提高辐射敏感性。2.2.过表达miR-124不同剂量辐射下凋亡相关蛋白的检测细胞在辐射后6h后检测蛋白水平的表达,Western blot结果显示：过表达miR-124细胞在辐射时可以降低Bcl-2的表达,而上调caspase-3和磷酸化的γ-H2AX。说明过表达miR-124在辐射时能增强癌细胞凋亡的效率,即miR-124能增强结直肠癌细胞辐射敏感性。3. PRRX1是miR-124下游直接调控的靶基因3.1生物信息学预测miR-124下游调控靶基因是PRRX1通过TargetScan在线软件预测miR-124与PRRX1的3’UTR区具有结合位点,并且在常用miRNA数据库TargetScan和Pictar中得到了初步验证。3.2荧光素酶报告系统验证PRRX1是miR-124的靶基因双荧光素酶报告系统显示,转染pLUC-3’UTR-PRRX1质粒的实验组中,miR-124组与miR-con组相比,荧光素酶活性降低；而anti-miR-124组与anti-miRcon组相比,荧光素酶活性升高,差异均具有统计学意义,P<0.05。在转染pLUC-3’UTR-mut-PRRX1质粒的实验组中,miR-124组与miR-con组相比荧光素酶活性无显著差异；anti-miR-124组与anti-miRcon组相比,荧光素酶活性也无显著差异。以上说明miR-124能够和PRRX1基因3’UTR区作用而抑制了荧光素酶的活性,证明PRRX1为miR-124的直接靶基因。3.3干扰PRRX1对结直肠癌细胞辐射敏感性Western blot结果显示,在结直肠癌细胞LOVO和SW480中,对于PRRX1的干扰是稳定有效的,辐射后细胞存活分数降低,差异有统计学意义。进一步Western blot检测凋亡相关蛋白,结果显示干扰PRRX1后辐射,与对照组相比,γ-H2AX和活性的caspase-3表达水平升高,Bcl-2表达水平降低,细胞凋亡增强,说明干扰PRRX1后结直肠癌细胞辐射敏感性增强。3.4过表达PRRX1可以逆转miR-124对结直肠癌细胞辐射敏感性的增强为了进一步明确PRRX1为miR-124调节结直肠癌辐射敏感性的一个功能性靶基因,在稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞LOVO和SW480中转染质粒pCDNA3.1-PRXX1,过表达PRRX1, westernblot和平板克隆实验结果显示,与对照组相比,细胞克隆形成率及存活分数升高,细胞辐射抵抗增强,证明PRRX1可以一定程度上逆转miR-124引起的辐射敏感性增强,同时Wester nblot实验结果发现,PRRX1可以逆转过表达miR-124引起的凋亡相关基因的的表达。以上结果表示PRRX1为miR-124增强结直肠癌辐射敏感性的一个功能性靶基因。3.5体内实验证明miR-124能够增强辐射的敏感性结果显示,未放疗组LV-con组与LV-miR-124组相比,肿瘤大小无明显差异,而放疗组LV-con+IR组与LV-miR-124+IR相比,肿瘤体积明显减小。我们绘制了肿瘤体积变化和放疗的天数关系图,结果显示：miR-124+IR组与LV-con+IR组相比,肿瘤的体积减小,随着放疗天数的增加,肿瘤体积增长的效率变小,肿瘤生长延迟。综上说明,我们发现miR-124能够增强肿瘤的辐射敏感性。结论：1.miR-124在结直肠癌细胞和组织中表达降低。2.过表达miR-124增强结直肠癌细胞辐射敏感性。3. PRRX1是miR-124下游直接调控的靶基因。4.干扰PRRX1能增强结直肠细胞辐射敏感性。5.过表达PRRX1可以逆转miR-124对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响。6.裸鼠成瘤实验证明miR-124在体内能够增强放疗的敏感性。