论文部分内容阅读
由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松树萎蔫病(pine wilt disease)是一种极具毁灭性的松林病害,导致包括中国在内的世界范围松林资源出现巨大的损失。在前期研究中,本实验室通过对松材线虫转录组进行高通量测序,获得了与其致病性相关的差异表达基因sodh-1的部分序列。在本研究中,根据sodh-1的部分序列,利用PCR技术首次从松材线虫的cDNA文库中克隆出松材线虫编码山梨醇脱氢酶(SODH-1)的完整开放阅读框(ORF),序列分析表明,该ORF全长是1059 bp,编码352个氨基酸。将松材线虫sodh-1基因与表达载体pET-15b连接构建重组表达质粒pET-15b-sodh-1。将构建好的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了工程菌。工程菌扩大培养后经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析表明,重组山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物主要是以包涵体形式存在。包涵体溶于8 mol/L尿素溶液,通过稀释复性法并经Ni2+树脂亲和层析得到可溶性的重组山梨醇脱氢酶。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白为41 kDa。对重组SODH-1蛋白催化反应的底物特异性进行分析,结果表明,纯化的重组山梨醇脱氢酶对供试的8种醇都具有一定的催化作用,但对正丙醇的催化作用明显高于其他7种醇类。在以正丙醇为底物时,纯化的重组松材线虫山梨醇脱氢酶最适温度是30°C,最适pH是pH8.0。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了松材线虫携带的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)以及乙醇对松材线虫山梨醇脱氢酶基因sodh-1表达水平的影响,结果显示荧光假单胞菌和乙醇皆可引起松材线虫sodh-1基因的上调表达,且荧光假单胞菌处理组sodh-1基因表达水平是无菌松材线虫对照组的2.65倍。松材线虫经4%和6%浓度乙醇处理后,其sodh-1基因表达水平明显高于对照组,分别是对照组的1.11倍和1.45倍。本研究首次分析了松材线虫sodh-1基因的特征和功能,并证明了松材线虫所携带的荧光假单胞菌、环境乙醇浓度与sodh-1基因表达水平之间存在明显的相关性,这为从分子水平上阐明松材线虫的致病机制奠定了基础。