论文部分内容阅读
无籽沙糖桔是由有籽沙糖桔芽变而来。经研究表明,无籽沙糖桔无籽的原因是配子体自交不亲和,自交不亲和反应的部位发生在子房。其自交不亲和是一个复杂的过程,有很多的基因参与其中,如F-box、S-RNase和泛素基因等都是该过程的关键基因。本文以无籽沙糖桔和有籽沙糖桔为实验材料,结合转录组测序技术,对花粉中的F-box基因、雌蕊中的S-RNase以及花粉、雌蕊中表达量差异较大的基因进行筛选分析。主要研究结果如下:1、根据转录组注释,筛选注释中含有F-box的Unigene,总共得到308个。在NCBI上面下载了14个物种中已经报道过的SLF或SFB,用于亲缘关系的分析。总共筛选到13条亲缘关系较近的Unigene。2、转录组中注释中含有RNase的基因共22个,注释中含有Ribonuclease的基因共121个,然后和已经报道过的24条RNase进行聚类分析,结果筛选到5条Unigene,分别是Unigene 0019191、Unigene0040115、Unigene0001013、Unigene0036542和Unigene0017501。其中Unigene 0019191和Unigene0040115是同一条基因的两个转录本,与已报道过的一条S-RNase基因(GU220071)相同。3、根据RPKM≥10值和|Log2 Ratio|≥5在转录组中筛选表达量较高且差异较大的基因,在花粉和雌蕊转录组中分别筛选到14条和30条差异较大的基因。4、在筛选到的13个F-box基因中,有7条基因在花粉中特异表达,分别是F-box4(Unigene0050323)、F-box5(Unigene0001060)、F-box6(Unigene0004230)、F-box7(Unigene0004222)、F-box8(Unigene0012037)、F-box9(Unigene0004272)、F-box11(Unigene0048889)。在有籽、无籽沙糖桔成熟花粉中表达量有差异的F-box基因有4条,分别是F-box6、F-box7、F-box9和F-box11。5、对4条F-box基因的cDNA、DN A及启动子序列进行测序分析,发现F-box7和F-box9 cDNA存在一些相同的杂合位点,而F-box6和F-box11 cDNA序列完全相同。F-box6、F-box9和F-box11的DNA全长分别含有1个、4个和5个相同的杂合位点,无籽沙糖桔和四倍体有籽沙糖桔中的F-box9序列无差异,但与有籽沙糖桔有差异。4条F-box基因的启动子序列均无差异。6、将筛选到的几条S-RNase进行组织特异性分析,结果表明S-Like RNase(Unigene0001013)在花粉、柱头、花柱和子房中均有表达,且有籽、无籽之间的表达量有较大差异,而RNase-P(Unigene0017501)没有明显的组织特异性,且在有籽、无籽各组织中无明显差异。对S-Like RNase进行测序分析,发现S-Like RNase的开放阅读框有678bp,cDNA序列无差异。7、对筛选出的44条差异较大的Unigene进行验证,结果显示,有24条Unigene与转录组数据相符。然后,通过不同时期的表达分析,发现除Unigene0018095和Unigene0031979外,大部分基因在自交、异交3-7d子房中的表达趋势都不相同。8、筛选了8条表达差异较大的基因进行组织特异性和测序分析,结果表明:copper transporter2和Pectate_lyase,分别在子房和花粉中特异表达,其他基因均无组织特异性。copper transporter2在有籽、无籽沙糖桔子房中的表达差异较大,而Pectate_lyase在有籽、无籽沙糖桔花粉中几乎没有差异。测序结果显示,除Copper transport-like基因和Fe(III)-chelate reductase基因cDNA序列有几个位点不同外,其余基因的c DNA序列也完全相同。bHLH101的启动子序列含有1个杂合位点,而在四倍体沙糖桔中却没有;无籽沙糖桔中的Copper transporter1启动子含有7个杂合位点,而在有籽、四倍体沙糖桔中并不存在;pectate_lyase启动子虽然同样含有多个杂合位点,但在有籽、无籽及四倍体沙糖桔中并无差异。