新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染所引起的一种急性并有高度接触性的禽类传染病。ND自从被发现以来,已经多次在世界范围内大型爆发过,对世界范围内的养禽业构成了十分严重威胁,目前是世界上最严重的禽类传染病之一。城疫病毒NDV按照致病型的不同一般分为三类,即速发型、中发型和缓发型。这其中,速发型NDV又可分为嗜内脏型和嗜肺脑型。消化道出血性病变是速发性嗜内脏型NDV的主要特征,其致死率高达90%以上。自从NDV的反向遗传系统被建立以来,已经成功拯救多个NDV毒株。众所周知,在表达载体相同的情况下,疫苗的免疫效果通常与所插入的具有免疫原性的外源基因的表达量息息相关。即外源基因表达量越高,免疫效果通常越好。但是,一般情况下,外源基因插入载体的位置不同,其表达量也会不同。NDV病毒载体传统的外源基因携带方式是将目的基因插入到两个病毒基因组基因之间,形成一个独立的基因框架,增加了病毒基因的数量。影响病毒的生长和复制。为了进一步确定外源基因的最佳表达位置,我们先后将内部核糖体进入位点-红色荧光蛋白IRES-RFP插入到NDV r La Sota载体的NP基因内部、P基因内部、M基因内部、F基因内部、HN基因内部以及L基因内部,成功的构建并拯救了一系列的外源基因(IRES-RFP)插入位置不同的重组NDV。通过分析TCID50、EID50、MDT、ICPI等多项生物学特性指标得出,拯救病毒r LS-NP-IRES-RFP,rLS-P-IRES-RFP,r LS-M-IRES-RFP,rLS-F-IRES-RFP,rLS-HN-IRES-RFP和r LS-L-IRES-RFP很好的保持了其亲本病毒rLa Sota弱毒株的生物学特性,并未发现任何毒力增强的现象。同时,病毒的生长曲线结果显示,所有拯救病毒均表现出了与rLa Sota病毒相似的复制特性及生长动力学特性。说明用IRES携带外源基因,插入在NDV基因组基因的尾部这一新的外源基因的携带方法对病毒的复制和生长几乎没有任何影响,很好的解决了传统方法将外源基因插入到基因组基因之间所带来的影响病毒生长复制的弊端。之后,我们又采用多功能酶标仪和Real-time PCR等检测手段,在蛋白水平和转录水平分别对重组病毒RFP基因的表达进行了鉴定,实验结果不仅首次系统直接的证实了新城疫病毒m RNA转录量是按照基因组3`至5`的顺序逐次递减的理论,更为重要的是,根据实验结果,与其他外源基因插入位点相比较,当IRES-RFP位于NDV rLa Sota载体NP基因内部作为第二个阅读框时,外源蛋白的表达量最高。这说明,在不影响病毒自身生长和复制的同时,通过IRES作为第二阅读框,NDV rLa Sota基因组NP基因内部为外源基因表达的最佳位置。