血栓栓塞性疾病(thromboembolic disease,TD)是一种常见的心脑血管病,常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等。该病不仅发病率高,而且致残率、致死率亦高,严重危害着人类的健康和生命。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已经发展了三代,但依然存在一定的缺陷,因此有待开发出一种安全有效的新型溶栓剂。本研究从久置的乙腈、饱血的雌性长角血蜱的唾液腺中分离到了三株具有纤维蛋白水解活性的细菌,分别命名为E12T、TSG2和TSG4T。通过对菌株的形态特征、生理生化特征、细胞化学组分和16S rRNA基因序列等多相分类学指标分析,最终确定了新分离的三个菌株的分类学地位:菌株E12T为气微菌属内的一个新种,命名为乙腈气微菌(Aeromicrobium acetonitrili sp.nov)；菌株TSG2为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；菌株TSG4T为寡养单胞菌属内的一个新种,命名为纤溶寡养单胞菌(Steronotrophomonas fibrinilytica sp.nov)。本研究首次从气微菌属发现了纤维蛋白原水解酶,并对三株菌发酵液中的纤溶酶进行了酶活测定、溶血活性测定和纤溶机制的初步研究。　　 E12T革兰氏染色阳性,菌体呈杆状或不规则杆状(0.2-0.4×0.7-1.4μm),无鞭毛,不能运动,无芽孢,无分枝菌丝,好氧,化能异养型。在TSB琼脂培养基上30℃培养4天的菌落形态为:浅黄色,圆形并向上微微凸起,边缘整齐,有光泽,直径0.9-1.1 mm。不能在麦康凯琼脂培养基上生长.菌株生长的温度范围是4-42℃,最适生长温度为25-37℃.菌株生长的pH范围是5.0-11.0,最适pH范围为6.0-8.0。E12工具有很强的NaCl忍耐力,能生长于0-10％(w/v)的盐浓度范围内。VP反应、MR反应阴性；不能产生H2S和吲哚；能使硝酸盐还原。过氧化氢酶、脲酶阳性；氧化酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶、DNA水解酶为阴性。能水解七叶苷、胆汁七叶苷、马尿酸盐、吐温20、40、60、80；不能水解淀粉、酪蛋白、纤维素、羧甲基纤维素。能使明胶液化。维生素B1、生物素,烟酸不是E12T生长所必需的,但是它们的存在能促进其快速生长。能利用D-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸作为唯一碳源和能源,并能发酵蔗糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-海藻糖产酸。E12T DNA G+C摩尔百分含量为72.6％。主要的甲基萘醌是MK-9(H4),细胞壁肽聚糖类型是A3γ型,诊断氨基酸是LL-2,6-二氨基庚二酸。细胞膜极性脂为DPG、PG、四个未知的磷脂和一个未知的脂。主要的脂肪酸为C18:1ω9c,C16:0,10-methyl C18:0,C18:0。16S rRNA序列同源性分析表明,E12T与其属内已发表的典型菌株序列同源性为95.5-96.6％,在系统进化树中形成一个独立的分支。通过以上多相分类学分析,最终确定菌株E12T为气微菌属内的一个新种,命名为乙腈气微菌。乙腈气微菌以1％接种量接入TSB,30℃、180 rpm震荡培养,15 h后纤溶酶活开始进入快速增长期,50 h时酶活达到最大(0.132 U·ml-1),而后进入衰退期。经灭活的和未灭活的琼脂糖-纤维蛋白平板检测,纤溶酶原未灭活的平板上出现透明的溶解圈,灭活的平板上出现模糊的溶解圈,且溶圈大于未灭活平板上的,说明乙腈气微菌纤溶酶只具有直接水解纤维蛋白的活性,而不具有激活纤溶酶原转化为纤溶酶的活性。乙腈气微菌纤溶酶可以有效地水解纤维蛋白原的α-链、β-链和γ-链,酶与纤维蛋白原37℃孵育15 Min,α-链和β-链就被彻底水解,孵育2 hγ-链也开始水解,6 h后被彻底水解。乙腈气微菌纤溶酶在浓度为0.0132 U·ml-1和0.065 U·ml-1时无溶血活性,有开发为新型溶/抗栓药物的应用潜力。　　 TSG4T革兰氏染色阴性,菌体呈杆状(0.6-0.8×1.2-2.4μm),端生单根鞭毛,能运动,无芽孢,兼性厌氧,化能异养型。在NB琼脂培养基上37℃培养48 h的菌落形态为:浅黄白色,圆形,较平坦,边缘整齐,透明,有光泽,直径1.6-1.8 mm。能在麦康凯琼脂培养基上生长。菌株生长的温度范围是4-37℃,最适生长温度为30-37℃。菌株生长的pH范围是5.0-10.0,最适pH范围为7.0-8.0。TSG4T能生长于0-5％(w/v)的NaCl浓度范围内,最适范围为0-3％。VP反应、MR反应阴性；不能产生H2S和吲哚；能使硝酸盐还原。过氧化氢酶、脲酶、赖氨酸脱羧酶、DNA水解酶阳性；氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶为阴性。能水解七叶苷、胆汁七叶苷、马尿酸盐、吐温20、40、60、80；不能水解淀粉、酪蛋白、纤维素、羧甲基纤维素。能使明胶液化。能利用D-果糖、D-甘露糖、麦芽糖、D-蜜二糖、D-葡萄糖、蔗糖、L-脯氨酸、L-酪氨酸、谷氨酸、L-丙氨酸等作为唯一碳源和能源,并能发酵麦芽糖、果糖产酸,甘露糖微弱产酸。TSG4TDNA G+C摩尔百分含量为68.3％。主要的脂肪酸为iso C15:0,C16:0和anteiso C15:0。16S rRNA序列同源性分析表明,TSG4T与其属内已发表的典型菌株序列同源性最高为99.5％,与嗜麦芽寡养单胞菌LMG958T的DNA-DNA杂交率(平均值)为60.2％。通过以上多相分类学分析,最终确定菌株TSG4T为寡养单胞菌属内的一个新种,命名为纤溶寡养单胞菌。纤溶寡养单胞菌以1％接种量接入NB,37℃、180 rpm震荡培养,9 h后纤溶酶酶活进入快速增长期,20 h时酶活达到最大(7.57 U·ml-1),而后进入衰退期。经灭活的和未灭活的琼脂糖-纤维蛋白平板检测,纤溶酶原未灭活的平板上出现透明的溶解圈,灭活的平板上出现中央透明边缘模糊的溶解圈,且溶圈略大于未灭活平板上的,说明纤溶寡养单胞菌纤溶酶只具有直接水解纤维蛋白的活性,而不具有激活纤溶酶原转化为纤溶酶的活性。纤溶寡养单胞菌纤溶酶可以有效地水解纤维蛋白原的α-链、β-链和γ-链,酶与纤维蛋白原37℃孵育15 min,α-链就被彻底水解,孵育1 hβ-链也被水解,当孵育12 h时,γ-链才能被彻底水解。纤溶寡养单胞菌纤溶酶在浓度为0.757 U·ml-1和1.514 U·ml-1时无溶血活性,有开发为新型溶/抗栓药物的应用潜力。　　 TSG2革兰氏染色阴性,菌体呈杆状(0.8-1.0×1.3-2.5μm),端生单根鞭毛,能运动,无芽孢,兼性厌氧,化能异养型。在LB琼脂培养基上37℃培养24h的菌落形态为:浅黄褐色,圆形至椭圆形,平坦,边缘不整齐,较透明,有光泽,直径1.4-1.6(1.5-1.8×1.8-2.5)mm。能在麦康凯琼脂培养基上生长。菌株生长的温度范围是10-45℃,最适生长温度为35-45℃。菌株生长的pH范围是5.0-10.0,最适pH范围为6.0-8.0。TSG2能生长于0-7％(w/v)的NaCl浓度范围内,最适范围为0-4％。VP反应、MR反应阴性；不能产生H2S和吲哚；不能使硝酸盐还原。过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、DNA水解酶阳性；鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶为阴性。能水解七叶苷、胆汁七叶苷、马尿酸盐、吐温20、40、60、80；不能水解淀粉、酪蛋白、纤维素、羧甲基纤维素。能使明胶液化。能利用D-葡萄糖、甘露醇、L-脯氨酸、L-酪氨酸、醋酸盐、丙二酸盐等作为唯一碳源和能源,并能发酵葡萄糖、甘露醇、果糖微弱产酸。TSG2 DNA G+C摩尔百分含量为66.2％。主要的脂肪酸为C16:0,C18:1ω7c和Cyclo C19:0ω8c。16S rRNA序列同源性分析表明,TSG2属于假单胞菌属,与铜绿假单胞菌的同源性为99.9％。结合形态学特征、生理生化特征、化学分类特征及遗传特征,最终确定菌株TSG2为铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌以1％接种量接入LB,37℃,180 rpm震荡培养,6h后纤溶酶酶活进入快速增长期,56 h时达到最大(76.42 U·ml-1),而后进入衰退期。经灭活的和未灭活的琼脂糖-纤维蛋白平板检测,纤溶酶原未灭活的平板上出现透明的溶解圈,灭活的平板上出现边缘稍模糊的透明溶解圈,且二者大小差不多,说明铜绿假单胞菌纤溶酶只具有直接水解纤维蛋白的活性,而不具有激活纤溶酶原转化为纤溶酶的活性。铜绿假单胞菌纤溶酶可以有效地水解纤维蛋白原的α-链、β-链和γ-链,酶与纤维蛋白原37℃孵育15 min,α-和β-链就被彻底水解,孵育1 h时γ-链也开始水解,当孵育3 h时,γ-链就被彻底水解。铜绿假单胞菌纤溶酶在浓度为7.642U·ml-1和1.5.284 U·ml-1时无溶血活性,有开发为新型溶/抗栓药物的应用潜力。　　 随着抗生素耐药性问题的日益严重,开发新型抗菌药物迫在眉睫。大量研究表明,抗菌肽是两栖类动物皮肤天然活性物质的重要组成部分,是抵抗微生物感染的第一道防线。本研究中,以来源于云南昆明的无指盘臭蛙为试验材料,对皮肤分泌液中抗菌肽的结构、功能及抗菌机理进行了研究。　　 通过SephadeX G-50凝胶过滤层析和反相高压液相层析,从无指盘臭蛙皮肤分泌物中分离到一种抗菌肽,命名为odorranain-NR。该抗菌肽由23个氨基酸残基组成,序列为GLLSGILGAGKHIVCGLTGCAKA。电喷雾质谱测得合成肽的表观分子量为2139.3 Da,与理论分子量(2139.6 Da)相吻合。同源性比对发现,odorranain-NR与两栖类抗菌肽nigrocin家族有很高的相似性,但是它的C末端含有一个由二硫键形成的六肽环状结构,而nigrocin家族却含有七肽环状结构。另外,odorranain-NR C末端的-AKA片段也不同于nigrocin家族,因此,确定它为一个新的抗菌肽家族。从无指盘臭蛙皮肤cDNA文库中筛选到3条编码odorranain-NR的核苷酸系列,这3条cDNA序列共编码2个前体,1个成熟的抗菌肽。　　 Odorranain-NR具有多种生物功能,首先是具有广谱的、高效的抗菌活性,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC2592、枯草芽孢杆菌以及真菌白色念珠菌ATCC2002有很强的杀灭作用,其最小抑菌浓度分别为9.38μg·ml-1、37.50μg·ml-1和18.75μg·ml-1。此外,odorranain-NR还具有抗氧化、抗肿瘤、促肥大细胞释放组胺的活性。在浓度为80μg·ml-1时,对DPPH·的清除率为15.25％,对ABTS·+的清除率为36.66％；在浓度为40μg·ml-1时,对人乳腺癌细胞系MCF-7生长的抑制率为22.37％；在浓度为50μg·ml-1时,促肥大细胞组胺释放率为19.86％。　　 细胞膜去极化分析结果表明odorranain-NR能使金黄色葡萄球菌ATCC2592细胞膜去极化,不能使枯草芽孢杆菌和白色念珠菌ATCC2002细胞膜去极化；透射电镜超微结构显示odorranain-NR严重地破坏了金黄色葡萄球菌ATCC2592的细胞壁和细胞膜,并在膜内形成类似囊泡状的结构；对白色念珠菌ATCC2002的细胞膜没有影响,膜内形成小的片层状囊泡结构；对枯草芽孢杆菌的细胞膜和细胞壁没有影响,也没有在膜内形成类似的囊泡状结构。上述两种不同的研究方法表明odorranain-NR对不同的微生物有不同的作用机理,对金黄色葡萄球菌ATCC2592的抗菌机理是在细胞膜上形成孔洞,膜内形成囊泡状结构；对白色念珠菌ATCC2002的抗菌机理是不在细胞膜上形成孔洞,只在细胞膜内形成片层状囊泡结构；对枯草芽孢杆菌则是通过其它机制来发挥抗菌作用。总之,odorranain-NR的发现进一步证实了无指盘臭蛙抗菌肽的多样性,其独特的分子内二硫键桥片段为抗生素药物的开发提供了潜在的模板。