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目的:辐射损伤在平时和战时均可发生,但对于合并辐射损伤的伤口愈合延缓甚至长期不愈合的机理尚未完全阐明。成纤维细胞是固有结缔组织中数量最多的细胞,也是参与创伤修复的主要细胞,其受损必然影响创伤后肉芽组织形成及其他组织修复过程,这可能是合并辐射损伤时创伤难愈的重要原因之一。Cyr61/CCN1(cysteine-rich 61)是CCN蛋白家族成员之一,能促进细胞增殖、黏附、分化,在血管发生、细胞外基质形成中起重要作用,但是CCN1与辐射损伤有何关系?其具体机制如何?目前尚不清楚。本课题在检测CCN1在辐射损伤小鼠成纤维细胞系L929细胞中表达情况的基础上,以CCN1条件培养液处理辐射损伤细胞,观察其对细胞生长、迁移以及对创伤愈合相关因子表达的调控。通过研究,初步探讨CCN1在辐射损伤后细胞创伤愈合中的作用及机制,为深入认识伤口愈合过程的机制提供新的视角,并为探索促愈治疗新药提供新的途径。方法:1.对小鼠成纤维细胞给予不同剂量(2、4、6、8 Gy)60Coγ射线辐照,计算细胞存活分数并绘制细胞存活曲线,确定辐射致L929细胞损伤的最适剂量。2.采用最适剂量4 Gy 60Coγ射线辐照L929细胞,利用MTT法、克隆形成试验检测辐射对细胞生长的影响,以DNA Ladder电泳法、TUNEL方法检测辐射后细胞凋亡情况,以流式细胞仪检测辐射对细胞周期的影响。3.应用ICC、RT-PCR检测4 Gy 60Coγ射线辐照L929细胞后不同时间(0、6、12、24、48、72 h) CCN1表达水平的变化,并以RT-PCR检测不同60Coγ射线辐射剂量(1、5、10 Gy)照射的L929细胞24 h CCN1的表达。4.应用HEK293细胞扩增带有标记基因RFP的重组腺病毒AdCCN1和对照AdRFP,并制备条件培养液:以AdCCN1和AdRFP分别感染CHO细胞,16 h后荧光显微镜下检测RFP表达,更换为低血清培养液继续培养,于48 h后收集培养上清液,冷冻、干燥浓缩后,Western Blot鉴定CCN1蛋白的表达。5.分别以CCN1和RFP条件培养液连续培养辐射损伤L929细胞,利用MTT法、克隆形成试验检测外源性CCN1处理辐射损伤L929细胞生长曲线及克隆形成率,划痕愈合试验、流式细胞仪分别检测干预后L929细胞迁移和L929细胞周期改变。6.应用RT-PCR方法检测条件培养液培养不同时间(1、3、5 d)辐射损伤L929细胞创伤愈合相关因子I型胶原(ColⅠ)、基质金属蛋白酶-1(MMP1)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP1)mRNA水平的表达。ICC方法检测干预5 d后辐射损伤L929细胞ColⅠ、MMP1及TIMP1蛋白水平的表达。结果:1.不同60Coγ射线辐射剂量皆会影响L929细胞的存活,根据绘制的细胞存活曲线图确定L929细胞的D37 (63%细胞死亡)为4 Gy。选择4 Gy 60Coγ射线作为本课题研究中L929细胞的辐射剂量。2.60Coγ射线对L929细胞生长的影响:①4 Gy 60Coγ射线辐照后2 d,L929细胞增殖受到明显抑制。辐射组的克隆形成数及克隆形成率显著低于对照组。②DNA Ladder电泳法未见DNA梯状谱形成,TUNEL染色未见阳性细胞。③各组L929细胞周期分布结果:4 Gy 60Coγ射线辐照后24 h,L929细胞周期的G2/M期增高了6.01倍,S期降低了7.06倍,G0/G1期降低了1.26倍,表明辐射可致L929细胞周期停滞在G2期。3.60Coγ射线对L929细胞CCN1表达的影响:ICC法、半定量RT-PCR法检测结果显示:60Coγ射线辐射后24、48h,L929细胞CCN1蛋白表达较对照组明显减弱。辐射组L929细胞CCN1 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.01),辐照后6 h CCN1 mRNA表达明显降低,至24小时后开始回调;不同60Coγ射线辐射剂量(1 Gy、5 Gy、10 Gy)照射的细胞CCN1 mRNA表达水平均显著低于对照组(P<0.05),且60Coγ射线辐射剂量越大,CCN1 mRNA表达水平越低。4.制备CCN1和RFP条件培养液,荧光显微镜下观察到二者有较强的荧光信号,且CCN1条件培养液经Western Blot检测出了CCN1蛋白的表达,RFP条件培养液则无。5.外源性CCN1对辐射损伤L929细胞的调节作用:①CCN1明显促进L929细胞的增殖。CCN1组的克隆形成数及克隆形成率均显著高于RFP组。②划痕损伤后细胞的愈合速率为:CCN1处理1~5 d,试验组组较对照组细胞趋于愈合(P<0.01)。如在1 d,CCN1组(18.73±5.33)%,RFP组(12.11±4.03)%,3 d时,CCN1组(74.48±9.19)%,RFP组(54.38±6.57)%。③各组L929细胞周期分布结果显示:CCN1条件培养液处理5 d的辐射损伤L929细胞与RFP组比较,细胞周期的S期增高了1.48倍,G2/M期降低了1.73倍,表明CCN1可促进细胞有丝分裂,从而促进细胞增殖。6.外源性CCN1对辐射损伤L929细胞中创伤愈合相关因子的调控:CCN1条件培养液处理辐射损伤L929细胞后1 d,细胞MMP1和TIMP1 mRNA均低于RFP组,ColⅠmRNA明显高于RFP组(P<0.01);第3 d,MMP1表达明显高于RFP组(P<0.01),TIMP1表达也高于RFP组,但无统计学意义,ColⅠ表达明显低于RFP组(P<0.01);第5 d,MMP1的阳性细胞平均光密度(MD)明显高于RFP对照组(P<0.05),TIMP1的表达也增强,ColⅠ的阳性细胞MD明显低于RFP对照组(P<0.05)。结论:1.4 Gy 60Coγ射线辐照的L929细胞,细胞增殖明显受到抑制,克隆形成能力明显下降,无凋亡现象,细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖。辐射后的L929细胞CCN1蛋白水平和mRNA水平的表达明显下调,且CCN1 mRNA表达下降水平与60Coγ射线辐射剂量大小呈正比。提示CCN1基因的表达水平低下可能与辐射导致细胞生长抑制有关。2.外源性CCN1可促进辐射后细胞增殖和迁移,使细胞周期S期明显增高,提示CCN1可能具有促进创伤愈合的作用,辐射后创伤难愈可能与CCN1表达下调有关。3.外源性CCN1在一定时限内可显著上调创伤愈合相关因子MMP1的表达,下调ColⅠ的表达。提示CCN1基因可能通过调控创伤愈合相关因子的表达,在促进辐射损伤愈合中发挥重要作用。