研究背景真菌性角膜炎是致盲率很高的感染性眼病,在我国居感染性角膜病致盲率的首位[11。近年来由于广谱抗生素及皮质类固醇激素的广泛使用,长期使用免疫抑制剂,角膜接触镜的佩戴增加,眼部手术的增加,其患病率有增加的趋势。外伤一直是真菌性角膜炎的主要诱因,特别是植物性外伤。引起角膜炎的真菌菌属在不同国家、不同地区、不同年代均有差别,总的来说,在发达地区和较寒冷地区常见致病菌为白色念珠菌,在发展中国家和气候温暖或炎热的地方,主要是镰刀菌和曲霉菌[3]。真菌性角膜炎可导致严重的角膜溃疡甚至角膜穿孔、眼内炎等并发症,常常危及整个眼球。目前真菌性角膜炎的致盲率及致残率居高不下,究其原因：一方面,由于目前尚缺乏广谱、高效、低毒的抗真菌药物；另一方面,由于真菌性角膜炎的临床表现较为复杂往往不能得到早期诊断治疗；并且,早期易被误诊为细菌性角膜炎或病毒性角膜炎,导致糖皮质激素的不合理使用,从而延误治疗,加重了病情。目前研究认为糖皮质激素一方面可增加真菌在角膜中的繁殖力和侵袭力,加速真菌的生长力,另一方面抑制蛋白合成促进蛋白分解而延长病损角膜的修复周期,加重真菌性角膜炎的病情。另外有研究者发现,在有效的抗真菌治疗下,疾病后期局部应用大剂量的激素则可阻止机体过强的免疫反应,减少新生血管和角膜混浊。目前糖皮质激素对真菌性角膜炎的影响机理尚不清楚,所以应从真菌性角膜炎基础研究入手,探究糖皮质激素的免疫调控机制,从而指导临床更加合理地使用糖皮质激素,达到既能有效控制感染又减少组织损伤的目的。固有免疫系统是机体抵御致病菌入侵的第一道防线,在感染早期担任限制病原体扩散的重要作用。中性粒细胞作为固有免疫系统重要成员,研究发现,当机体发生炎症或感染时,中性粒细胞首先募集至炎症、感染部位,主要通过吞噬作用,产生活性氧,及脱颗粒释放抗菌肽杀伤病原体,同时产生一些炎症因子趋化更多的炎症细胞[6]。这些作用一方面能够有效地杀灭病原体,对早期感染的控制具有重要意义,但另一方面释放多种生物活性介质,导致强烈的炎症反应造成自身组织的损伤,在角膜炎中,引起角膜的炎症反应,新生血管、疤痕的形成,甚至角膜穿孔等严重后果。近来研究发现,中性粒细胞还可以通过一种称之为中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)的新机制杀灭病原菌,与经典的吞噬作用杀灭病原菌胞内途径明显不同,NETs是中性粒细胞通过胞外途径来杀灭病原菌。中性粒细胞通过细胞核常染色质和异染色质均质化、核膜和颗粒膜破裂,核内物质与细胞质的物质混合,最后阶段细胞膜的破裂,混合物在胞外形成一种以DNA为骨架结合一些抗菌蛋白的网状结构,即NETs结构[9].NETs的形成过程与细胞凋亡及细胞死亡有明显的区别,为一种新的程序性细胞死亡,现将其命名为NETosis[10]。 NETs通过网状结构对病原菌进行包围限制其扩散,再通过其上附着的高浓度的组蛋白、钙网蛋白、蛋白酶G等抗菌蛋白对病原体进行杀灭。目前在许多炎症、感染性疾病中发现NETs的形成,提示其在炎症、感染性疾病中发挥着重要的作用,另外,越来越多的研究表明过度地产生NETs将会导致炎症持续存在,以及造成机体本身的组织损伤,NETs量的多少与炎症反应诱发的二次损伤发生有着紧密的联系。但是,由于角膜缺乏血管,NETs形成后的转归仍不得而知,我们推测由于角膜缺乏血管,NETs更易积存,可能与角膜炎感染控制后的炎症反应、角膜自溶及角膜疤痕形成有关。鉴于NETs的双重性作用,如何通过对NETs形成的干预与调控来影响感染的控制和预后具有重要的临床意义。糖皮质激素强大的抗炎及免疫抑制作用,NETs作为中性粒细胞重要的杀菌模式,糖皮质激素是否通过影响NETs的形成而影响真菌性角膜炎的病情,如果能揭示糖皮质激素与NETS之间的某些联系,那么局部合理地使用糖皮质激素,或许能够达到既有效控制感染又减少组织损伤的目的。本研究围绕这一目的分两步走,首先通过建立模拟真菌性角膜炎自然感染过程的小鼠真菌性角膜炎动物模型,观察真菌性角膜炎动物模型的自然发展过程,及自然发展过程中NETs在真菌性角膜炎中的作用,并在角膜炎发展的不同阶段行组织病理学检查,观察角膜炎发展过程中角膜组织内真菌病原体的繁殖情况,进一步研究糖皮质激素对实验性真菌性角膜炎的临床表现、组织病理学表现、以及NETs形成的影响,探究糖皮质激素是否通过影响NETs的形成而影响真菌性角膜炎的病程。以期增加我们对糖皮质激素影响真菌性角膜炎发病机制的认识,从而为临床研究提供实验依据。研究目的评价NETs在真菌性角膜炎中的作用,探讨糖皮质激素是否通过干预NETs的形成影响真菌性角膜炎的病程。研究方法选用相同周龄的C57BL/6小鼠,采用角膜表层镜片法建立小鼠真菌性角膜炎模型,随机将动物模型分为白色念珠菌性角膜炎未干预组,地塞米松组、及损伤对照组。白色念珠性角膜炎未干预组及地塞米松处理组均接种白色念珠菌(麦氏浊度=0.7),损伤对照组均接种生理盐水。接种48小时后拆线,地塞米松组给予0.1%地塞米松磷酸钠溶液滴眼,1滴/次,3次/天,连续点3天,未干预组给予生理盐水,1滴/次,3次/天,连续点3天。每天进行裂隙灯检查,采集图片,并进行临床评分,角膜刮片进行免疫荧光染色观察溃疡物中菌丝、中性粒细胞及NETs的变化情况,在感染后的不同时间点进行受染角膜组织中真菌负荷量的计算,及病理学检查受染角膜组织中炎性细胞的浸润和真菌的生长情况,另外进行扫描电镜观察NETs的形态及超微结构的变化。比较地塞米松组与未干预组之间的差异。所有的数据均采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理,采用非参数检验中Mann-Whitney U检验进行统计分析。P<0.05为差异有显著意义。(以a=0.05为检验水准)。结果1.角膜表层镜片法可以成功建立典型的小鼠真菌性角膜炎模型。病灶内大量浸润的中性粒细胞形成致密的NETs,网捕白色念珠菌限制其扩散。2.地塞米松组小鼠病情进展加快,病情加重,病程延长,10天内角膜炎临床评分明显高于未干预组,差异有统计学意义(Zd1=0.00,P=1.0;Zd3=-2.02,P=0.043;Zd5=-5.23,P=0.00,Zd7=-7.10,P=0.00::Zd10=-7.21,P=0.00)。病理检查及角膜组织匀浆培养均显示地塞米松组角膜内真菌负荷量明显多于未干预组(D3地带米松组1616.67±169.29CFU/cornea未干预组766.67±289.76CFU/cornea;).地塞米松组真菌生长速度加快,菌丝增长增粗,侵袭力增加,但是病灶内菌丝集中区却缺乏中性粒细胞。扫描电镜观察超微结构发现,使用激素后,角膜表面形成致密的菌丝苔被,苔被下大量菌丝,但浸润的中性粒细胞较少,菌丝周围NETs结构较未干预组网状纤维稀疏,网状纤维上附着的颗粒蛋白也较少。结论1.真菌性角膜炎中中性粒细胞能通过形成NETs捕获真菌,在抗感染过程中NETs与吞噬作用同时存在共同防御真菌感染。2.糖皮质激素能够减少角膜中中性粒细胞的浸润,减少NETs的形成,减弱NETs的杀菌能力,同时激素能促进白色念珠菌的生长,增强其侵袭力,从而加重真菌性角膜炎病情,延迟愈合,延长病程。