蓖麻蚕核型多角体病毒的基因组分析及其miRNA预测与验证

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杆状病毒是有嚢膜的dsDNA病毒,专一性地感染节肢动物,在感染周期产生2种表型不同但是遗传物质完全一样的病毒形态,即包涵体衍生病毒(Occlusion-derived virus,ODV)和出芽型病毒(Budded virus,BV)。蓖麻蚕核型多角体病毒(Phitosamia cynthiaricini nuclear polyhedrosis virus,PhcyNPV)是引起蓖麻蚕病毒病的主要病原,在形态上和柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi NPV,AnpeNPV)大小相仿,而与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV,BmNPV)差别较大。对蓖麻蚕核型多角体病毒的研究将丰富杆状病毒家族的成员,为探明该病原的感染机制、蓖麻蚕核型多角体病的流行规律以及稳定蓖麻蚕产业都具有重要的理论意义和实用价值。本研究测定了1株蓖麻蚕核型多角体病毒(PhcyNPV)的全基因组序列,并进行了解析;克隆了蓖麻蚕核型多角体病毒的gp64基因,并初步建立了用荧光定量PCR检测蓖麻蚕品种资源抗病毒能力的技术体系;用生物信息学方法预测了蓖麻蚕核型多角体病毒的miRNA及其在病毒基因组上的靶基因,对于蓖麻蚕核型多角体病毒感染机制的研究具有一定的理论意义。主要研究结果如下:  1.对蓖麻蚕核型多角体病毒基因组进行测序(6.6×),经过拼接,得到基因组全长125376 bp,其中G+C含量占53.65%;PhcyNPV全基因组中有138个ORF、6个同源重复区(hr)以及2个bro,其中63个ORF的转录方向与多角体蛋白基因的转录方向一致,其它74个ORF转录方向相反,在所有的ORF中约有94.9%的ORF在其他杆状病毒的功能已经解析或者有同源基因。预测了PhcyNPV ORF表达产物的细胞学定位,有23个基因产物定位在内质网上,19个基因产物定位在线粒体上。通过对pif-2和lef-8基因序列分析得到的杆状病毒分子进化树中,PhcyNPV与AnpeNPV亲缘关系最近,而与BmNPV亲缘关系较远,PhcyNPV属于GroupⅠNPV。  2.将PhcyNPV基因组与已经公布的2株AnpeNPV基因组比较,这3个病毒基因组中有126个共同的保守基因,其中包括29个杆状病毒的核心基因。另外每个病毒又有自身独特的一些ORF,PhcyNPV有7个,AnpeNPV-L2有6个,AnpeNPV-Z有7个。PhcyNPV与AnpeNPV基因组的主要变化有:在PhcyNPV基因组的30622~32874之间缺失cath和v-chi2个基因;38639~39754bp之间3个ORF的长度和功能与AnpeNPV中均不相同;PhcyNPV的p94、egt、pif-3发生了基因突变;与晚期基因转录有关的lef-10和lef-11在PhcyNPV基因组中也缺失。  3.根据蓖麻蚕核型多角体病毒基因组信息,克隆了PhcyNPV的gp64基因,该基因全长1530bp,编码509个氨基酸,生物信息学分析表明该基因与AnpeNPV的gp64基因同源性高达99%,而与BmNPV的同源性仅为76%。对PhcyNPV的gp64和p49两个基因进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定,结果显示这2个基因在不同品种的同一组织中都有相似的表达增殖趋势,但是在不同感受性的品种中,这2个基因的拷贝数不同,即在易感品种中拷贝数急剧增加,尤其是在感染后期易感品种(B21)脂肪体组织中的拷贝数远远高于非易感品种。因此认为,可以通过实时荧光定量PCR检测蓖麻蚕感染PhcyNPV后相关基因的表达水平来判断不同蓖麻蚕品种对PchyNPV感受性强弱,藉此初步筛选不同蓖麻蚕品种抗PhcyNPV性能,为从分子水平检测蓖麻蚕种质资源的抗病性提供相应的技术方法。  4.通过生物信息学的方法预测了PhcyNPV基因组中142条可能编码的miRNA成熟体分子,再用miRanda、RNAhybird两个软件预测miRNA在病毒基因组上的靶基因,提取靶基因有共同交集的miRNA33条,其共同的靶基因61个。对这33条可能编码的miRNA序列进行RT-PCR验证,确定其中的6条为miRNA成熟体序列。这6条miRNA的靶基因涉及病毒的融合蛋白、多角体蛋白等结构蛋白以及一些蛋白激酶包括激活解旋酶表达的极早期基因等,可见 miRNA通过调控潜在的靶基因,参与了PhcyNPV病毒的复制及侵染等重要过程。
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