肺高压(pulmonary hypertension,PH)的特点是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)静息胞浆游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)增高、血管收缩增强和血管重塑。近来研究表明经典瞬时感受器电位(canonical transient receptor potential,TRPC)蛋白、间质相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)和Orai是钙池操纵性钙内流(sotre-operated calcium entry,SOCE)激活机制中的重要分子,活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NAFTc)与细胞增殖有关,在慢性低氧性肺高压(chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension,CHPH)和野百合碱(monocrotaline,MCT)致PH大鼠中TRPC介导的SOCE增强。本研究进一步在CHPH大鼠模型基础上,观察STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路在CHPH发病过程中的作用;采用NFATc间接抑制剂环孢素(cyclosporin A,Cs A)预处理,观察其对CHPH大鼠的影响,以进一步明确STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路的作用;并观察人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,Rb1)对CHPH大鼠肺动脉(pulmonary arteries,PAs)SOCE的作用,以期为PH治疗提供新的靶向药物。第一部分CHPH大鼠肺动脉STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路的变化目的:观察STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路在CHPH大鼠发病过程中的作用,及其病理生理学意义。方法:在SD大鼠常压慢性低氧(chronic hypoxia,CH)21 d建立CHPH大鼠模型的基础上,采用:①血流动力学和PAs形态学检测方法,测定大鼠右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)、右心重量指数(right ventricular mass index,RVMI)和PAs形态的变化;②荧光定量PCR和Western blot检测方法,测定大鼠PAs STIM-Orai/TRPC-NFATc m RNA表达水平,及表达上调m RNA的时间曲线;③血管环张力检测方法,测定钆离子(gadolinium,Gd3+)舒张内皮素-1(endothelin-1,ET-1)收缩大鼠PAs效应,及环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱导大鼠PAs收缩效应;④Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测[Ca2+]i方法,测定CPA诱导大鼠PASMCs胞膜Ca2+内流速率和[Ca2+]i升高的作用;⑤MTT法,测定大鼠PASMCs的增殖情况;⑥时间曲线和线性相关分析方法,观察表达上调m RNA之间的相关性,以及与CPA诱导PAs收缩效和RVSP之间的相关性。结果:与正常对照组相比,①CHPH模型大鼠的RVSP和RVMI均显著增高,肺内小动脉管壁增厚,管腔狭窄,提示CHPH大鼠模型成功建立;②CHPH大鼠PAs STIM2-Orai2-TRPC1/6-NFATc2/3 m RNA和STIM2-Orai2-TRPC1/6蛋白表达明显增高,提示CHPH的STIM2-Orai2-TRPC1/6-NFATc2/3表达上调;③CHPH大鼠的ET-1收缩PAs效应显著增高,且Gd3+对ET-1收缩PAs效应的舒张作用也显著增大,提示CHPH大鼠PAs的高ET-1反应性和SOCE功能增强;④CHPH大鼠的CPA诱导PAs收缩效应显著增高,进一步提示CHPH大鼠PAs SOCE功能增强;⑤CHPH大鼠PASMCs的静息[Ca2+]i、CPA诱导胞膜Ca2+内流速率和[Ca2+]i升高幅度均显著增高,提示CHPH大鼠PASMCs SOCE功能增强,且其可能是引起静息[Ca2+]i增高的重要因素;⑥CHPH大鼠PASMCs的增殖活性增强,提示CHPH大鼠PASMCs NFATc介导的功能增强;⑦Orai2-TRPC1-NFATc3表达上调和CPA诱导PAs收缩效应均先于RVSP的升高,且Orai2-TRPC1和CPA诱导PAs收缩效应与其它因素均具有很强的相关性,提示Orai2/TRPC1及其介导的SOCE功能增强可能是该信号通路的核心环节和启动因素。结论:CH可诱导大鼠产生PH;其机制可能是CHPH大鼠的STIM2-Orai2-TRPC1-NFATc2/3表达上调,引起STIM2-Orai2/TRPC1所介导的SOCE功能增强和NFATc2/3介导的PASMCs增殖活性增强,导致[Ca2+]i增高、PAs血管收缩增强、PAs对ET-1的高反应性、血管平滑肌增殖和血管重塑;并且Orai2/TRPC1及其介导的SOCE功能增强可能是CHPH致病过程中的核心环节和启动因素。第二部分环孢素A干预对CHPH大鼠肺动脉STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路的作用目的:观察Cs A预处理对CHPH大鼠的影响,以进一步明确STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路在大鼠CHPH发病过程中的作用方法:在1.25%Cs A隔天腹腔注射25 mg/kg干预CHPH大鼠模型的基础上,采用:①血流动力学和PAs形态学检测方法,测定大鼠RVSP、RVMI和PAs形态的变化;②荧光定量PCR检测方法,测定大鼠PAs STIM-Orai/TRPC-NFATc m RNA表达水平的变化;③血管环张力检测方法,测定Gd3+舒张ET-1收缩大鼠PAs效应,及CPA诱导大鼠PAs收缩效应的变化;④Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测[Ca2+]i方法,测定CPA诱导大鼠PASMCs胞膜Ca2+内流速率和[Ca2+]i升高作用的变化;⑤MTT法,测定大鼠PASMCs增殖情况的变化;⑥时间曲线分析方法,RVSP和RVMI变化的时间关系。结果:与CH组相比,①Cs A干预大鼠的RVSP和RVMI显著降低,肺内小动脉管壁变薄,管腔增大,提示Cs A干预能抑制CHPH大鼠模型;②Cs A干预大鼠PAs Orai2-TRPC1-NFATc2/3 m RNA表达显著减小,但对STIM2 m RNA表达无影响,提示Cs A干预抑制CHPH大鼠Orai2-TRPC1-NFATc2/3表达上调;③Cs A干预大鼠的ET-1收缩PAs效应显著减小,且Gd3+对ET-1收缩PAs效应的舒张作用也显著减小,提示Cs A干预抑制CHPH大鼠PAs的高ET-1反应性和SOCE功能增强;④Cs A干预大鼠的CPA诱导PAs收缩效应显著减小,进一步提示Cs A干预抑制CHPH大鼠Pas的SOCE功能增强;⑤Cs A干预显著下降CHPH大鼠PASMCs静息[Ca2+]i、CPA诱导胞膜Ca2+内流速率和[Ca2+]i升高幅度,提示Cs A干预抑制CHPH大鼠PASMCs的SOCE功能增强,且其可能是静息[Ca2+]i下降的重要因素;⑥Cs A干预大鼠PASMCs的增殖活性减弱,提示Cs A干预抑制CHPH大鼠PASMCs NFATc介导的功能增强;⑦Cs A干预无法抑制RVSP初期的升高,但可使RVSP后期的升高幅度显著下降及RVSP最高值提前,并可抑制RVMI的增加,提示在CHPH致病过程中血管收缩增强可能起着启动作用,而血管增殖和重塑可能起着巩固和加强作用。结论:Cs A干预能抑制CHPH大鼠模型;其机制可能是Cs A干预下调CHPH大鼠Orai2-TRPC1-NFATc2/3的表达,抑制Orai2/TRPC1介导的SOCE功能增强和NFATc2/3介导的PASMCs增殖活性增强,导致静息[Ca2+]i下降、PAs血管收缩减弱、PAs对ET-1的反应性减轻、血管平滑肌增殖减弱和血管重塑减轻。血管收缩增强在CHPH致病过程中可能起着启动作用,而血管增殖和重塑可能起着巩固和加强作用。第三部分人参皂苷Rb1对CHPH大鼠肺动脉SOCE的作用目的:观察Rb1对正常大鼠和CHPH大鼠PAs的血管效应和机制,为PH治疗提供新的靶向药物。方法:在CHPH大鼠模型的基础上,采用PAs血管环张力检测、Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测[Ca2+]i方法,观察:①Rb1对正常大鼠PAs的血管效应;②Rb1对ET-1诱导正常大鼠和CHPH大鼠PAs收缩的作用;③Rb1对CPA诱导正常大鼠和CHPH大鼠PAs收缩的作用;④Rb1对CPA诱导正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs胞膜Ca2+内流速率的影响;⑤Rb1对CPA诱导正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs[Ca+]i升高的影响。结果:①Rb1对KCl、ET-1和Nif预处理ET-1收缩正常大鼠PAs效应均具有浓度依赖性舒张作用,且对ET-1收缩的舒张作用最显著,提示Rb1对正常大鼠PAs收缩效应的舒张作用主要通过阻断非电压依赖性Ca2+内流产生的事;②Rb1预处理可抑制ET-1对正常大鼠和CHPH大鼠PAs的收缩效应,且可抑制CHPH大鼠PAs对ET-1的高反应性,从另一方面支持其作用机制主要通过阻断非电压依赖性Ca2+内流;③Rb1对ET-1预收缩正常大鼠和CHPH大鼠PAs效应具有显著舒张作用,且对CHPH大鼠PAs的作用更强,但在Gd3+舒张ET-1预收缩后无进一步明显的舒张作用,提示Rb1主要是通过抑制SOCE,发挥其对大鼠PAs收缩环效应的舒张作用;④Rb1预处理可显著抑制CPA诱导正常大鼠和CHPH大鼠PAs的收缩效应,且对CHPH大鼠PAs的抑制作用更强,进一步提示Rb1可通过抑制SOCE抑制大鼠PAs的收缩效应,且也抑制CHPH大鼠PAs SOCE功能增强;⑤Rb1对CPA诱导预收缩正常大鼠和CHPH大鼠PAs效应也具有显著舒张作用,从另一方面支持Rb1通过抑制SOCE舒张大鼠PAs的收缩效应;⑥Rb1可抑制CPA诱导正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs胞膜Ca2+内流速率和[Ca2+]i升高的作用,提示Rb1可抑制大鼠PASMCs的SOCE功能。结论:Rb1通过抑制SOCE,发挥其抑制和舒张大鼠PAs血管的收缩效应,并且可抑制CHPH大鼠PAs的SOCE功能增强。综上所述,STIM-Orai/TRPC-NFATc信号通路在CHPH致病过程中起着关键作用。CH通过上调STIM2-Orai2-TRPC1-NFATc2/3表达,介导SOCE功能和PASMCs增殖活性增强,导致静息[Ca2+]i增高、PAs血管收缩增强、血管平滑肌增殖和血管重塑,诱发PH。Cs A通过下调Orai2-TRPC1-NFATc2/3的表达,介导SOCE功能和PASMCs增殖活性减弱,导致静息[Ca2+]i下降、PAs血管收缩减弱、血管平滑肌增殖减弱和血管重塑减轻,抑制CHPH。Rb1通过抑制SOCE,发挥其抑制和舒张大鼠PAs血管的收缩效应,并且可抑制CHPH大鼠PAs的SOCE功能增强。以上结果为指导PH治疗提供新依据和新靶点,并可能为PH治疗提供新的靶向药物。