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主动脉瘤是一种发病率和死亡率极高的血管疾病，严重威胁人类健康。目前尚无特效药用于主动脉瘤的治疗。肌浆网/内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）是调控细胞内钙稳态的关键酶。SERCA2是心血管系统中SERCA的主要亚型，包括2a和2b。第674位半胱氨酸（cysteine674,C674）位于胞浆侧，是SERCA2的关键氧化还原位点。生理情况下C674被谷胱甘肽化，增加SERCA2的活性；病理情况下，C674发生不可逆性氧化（C674-SO3H）导致该位点的失活，抑制SERCA2的活性。在血管重构类疾病如新内膜增生和动脉粥样硬化样本中，均发现C674-SO3H增加。在本研究中，我们发现在人和小鼠的主动脉瘤，C674-SO3H也明显增加，推测C674失活参与主动脉瘤的进程。关于SERCA2及其C674与主动脉瘤的关系尚未报道。我们将674位半胱氨酸突变成丝氨酸（S674）来模拟C674失活，在C57/BL6J遗传背景下构建了受SERCA2内源性启动子调控的C674S基因敲入（SERCA2C674S knock-in，SKI）小鼠，来自同窝（无S674）的野生型（wild type,WT）小鼠作为对照。纯合子小鼠具有胚胎致死性。杂合子小鼠（以下简称SKI）含有一半C674和一半S674，模拟了C674在病理情况下的部分失活（以下简称C674失活）。我们将SKI转入低密度脂蛋白受体基因缺陷型（LDLR-/-）背景进行血管紧张素Ⅱ（angiotensionⅡ,AngⅡ）诱导的主动脉瘤研究。通过细胞生物学、分子生物学、药理学和表达谱等方法，探讨C674失活与主动脉瘤形成的关系及网络调控机制，本研究主要得到以下结果和结论：
①通过序列比对分析发现，不同物种在674位点附近均存在半胱氨酸位点，小鼠SERCA的各个亚型在674位点（有的亚型是675位点）均存在保守的半胱氨酸，表明C674在进化过程中高度保守，提示其重要性。
②LDLR-/-雄性小鼠，给与AngⅡ（1000ng/kg/min）灌注28天可以诱导小鼠主动脉瘤的发生。免疫组化和免疫荧光染色显示在AngⅡ诱导的主动脉和人的主动脉瘤体，C674-SO3H的表达明显增加，尤其是平滑肌层。表明C674失活参与主动脉瘤的进程。
③在C57/BL6J背景的主动脉平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）中，C674失活增加胞内Ca2+浓度；上调钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）活性，促进活化T细胞核因子4（nuclear factor of activated T cells,NFAT4）和核因子κB（nuclear factor kappa B,NFκB）的入核。在WT的SMC，过表达人源SERCA2a S674和SERCA2b S674缺陷型腺病毒均促进NFAT4入核。在SKI的SMC，CaN抑制剂环孢素A（cyclosporin,CsA）阻止NFAT4和NFκB入核。表明C674失活激活胞浆Ca2+依赖性CaN-NFAT4/NFκB信号通路。
④在主动脉以及SMC，C674失活增加SMC去分化型标志相关蛋白骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloprotein，MMP2）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ,ColⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen typeⅢ,ColⅢ）、血管细胞粘附因子（vascular cell adhesion molecule1,VCAM1）、细胞间黏附因子（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM1）和磷酸化p65NFκB（phospho-p65NFκB，p-p65NFκB）的表达，抑制分化型标志蛋白心肌素（myocardin,MYOCD）的表达；促进SMC的增殖、迁移以及巨噬细胞对SMC的粘附，说明C674失活诱导SMC表型转换，导致SMC具有了增殖、迁移、合成和分泌炎性因子等能力，参与血管重构。在SKI的SMC，CsA和NFκB抑制剂1-吡咯烷二硫代羧酸铵盐（pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC）均能抑制SKI的SMC的表型转换；胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM部分逆转与SMC表型转换相关蛋白的表达。表明C674失活导致的胞内Ca2+增加，激活了Ca2+依赖性CaN-NFAT4/NFκB信号通路，促进SMC表型转换。
⑤通过表达谱分析，发现受C674失活调控的40个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），主要富集在20个通路，包括丙酮酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体、氧化磷酸化和心肌收缩调控等信号通路。在主动脉及SMC，通过qPCR和免疫印迹方法证实C674失活抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ2）的转录和PPARγ（PPARγ1和PPARγ2）的蛋白表达。PPARγ激活剂吡格列酮（piglitazone，PIOG）干预或过表达PPARγ2均能抑制SMC的表型转换。表明C674失活通过抑制PPARγ促进SMC表型转换。
⑥通过构建小鼠PPARγ2-Luciferase启动子载体发现，C674失活抑制PPARγ2启动子的活性，且可以被CsA或PDTC逆转，表明NFAT4和NFκB通过与PPARγ2启动子结合来抑制其转录。在SKI的SMC，CsA和PDTC增加PPARγ的蛋白表达水平；激活PPARγ抑制NFAT4和NFκB的入核，表明CaN-NFAT4/NFκB和PPARγ之间可以彼此负向调控，而C674失活打破了三者之间的平衡，促进SMC表型转换。
⑦LDLR-/-背景的雄性小鼠进行AngⅡ诱导主动脉瘤研究。SKI（SKI/LDLR-/-）小鼠及其WT（LDLR-/-）对照小鼠背部皮下植入AngⅡ微渗透泵一周后,SKI小鼠随机分为两组，分别给与PIOG灌胃（SKI/PIOG组）或等体积的双蒸水灌胃（SKI/Ctrl组）。WT小鼠给与同等体积的双蒸水灌胃（WT/Ctrl组）。与WT/Ctrl组相比，SKI/Ctrl组生存率低，主动脉瘤更为严重。SKI/Ctrl组的小鼠死亡率、主动脉瘤发生率、瘤体数目、主动脉瘤破裂比例、弹性蛋白降解程度、瘤体扩张和胶原沉积增加，这些指标在SKI/PIOG组都得到明显改善，且恢复到与WT/Ctrl组相似的水平。表明C674失活加剧AngⅡ诱导的主动脉瘤，而PIOG可以减轻C674失活对主动脉瘤进程的调控。
①通过序列比对分析发现，不同物种在674位点附近均存在半胱氨酸位点，小鼠SERCA的各个亚型在674位点（有的亚型是675位点）均存在保守的半胱氨酸，表明C674在进化过程中高度保守，提示其重要性。
②LDLR-/-雄性小鼠，给与AngⅡ（1000ng/kg/min）灌注28天可以诱导小鼠主动脉瘤的发生。免疫组化和免疫荧光染色显示在AngⅡ诱导的主动脉和人的主动脉瘤体，C674-SO3H的表达明显增加，尤其是平滑肌层。表明C674失活参与主动脉瘤的进程。
③在C57/BL6J背景的主动脉平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）中，C674失活增加胞内Ca2+浓度；上调钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）活性，促进活化T细胞核因子4（nuclear factor of activated T cells,NFAT4）和核因子κB（nuclear factor kappa B,NFκB）的入核。在WT的SMC，过表达人源SERCA2a S674和SERCA2b S674缺陷型腺病毒均促进NFAT4入核。在SKI的SMC，CaN抑制剂环孢素A（cyclosporin,CsA）阻止NFAT4和NFκB入核。表明C674失活激活胞浆Ca2+依赖性CaN-NFAT4/NFκB信号通路。
④在主动脉以及SMC，C674失活增加SMC去分化型标志相关蛋白骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloprotein，MMP2）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ,ColⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen typeⅢ,ColⅢ）、血管细胞粘附因子（vascular cell adhesion molecule1,VCAM1）、细胞间黏附因子（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM1）和磷酸化p65NFκB（phospho-p65NFκB，p-p65NFκB）的表达，抑制分化型标志蛋白心肌素（myocardin,MYOCD）的表达；促进SMC的增殖、迁移以及巨噬细胞对SMC的粘附，说明C674失活诱导SMC表型转换，导致SMC具有了增殖、迁移、合成和分泌炎性因子等能力，参与血管重构。在SKI的SMC，CsA和NFκB抑制剂1-吡咯烷二硫代羧酸铵盐（pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC）均能抑制SKI的SMC的表型转换；胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM部分逆转与SMC表型转换相关蛋白的表达。表明C674失活导致的胞内Ca2+增加，激活了Ca2+依赖性CaN-NFAT4/NFκB信号通路，促进SMC表型转换。
⑤通过表达谱分析，发现受C674失活调控的40个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），主要富集在20个通路，包括丙酮酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体、氧化磷酸化和心肌收缩调控等信号通路。在主动脉及SMC，通过qPCR和免疫印迹方法证实C674失活抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ2）的转录和PPARγ（PPARγ1和PPARγ2）的蛋白表达。PPARγ激活剂吡格列酮（piglitazone，PIOG）干预或过表达PPARγ2均能抑制SMC的表型转换。表明C674失活通过抑制PPARγ促进SMC表型转换。
⑥通过构建小鼠PPARγ2-Luciferase启动子载体发现，C674失活抑制PPARγ2启动子的活性，且可以被CsA或PDTC逆转，表明NFAT4和NFκB通过与PPARγ2启动子结合来抑制其转录。在SKI的SMC，CsA和PDTC增加PPARγ的蛋白表达水平；激活PPARγ抑制NFAT4和NFκB的入核，表明CaN-NFAT4/NFκB和PPARγ之间可以彼此负向调控，而C674失活打破了三者之间的平衡，促进SMC表型转换。
⑦LDLR-/-背景的雄性小鼠进行AngⅡ诱导主动脉瘤研究。SKI（SKI/LDLR-/-）小鼠及其WT（LDLR-/-）对照小鼠背部皮下植入AngⅡ微渗透泵一周后,SKI小鼠随机分为两组，分别给与PIOG灌胃（SKI/PIOG组）或等体积的双蒸水灌胃（SKI/Ctrl组）。WT小鼠给与同等体积的双蒸水灌胃（WT/Ctrl组）。与WT/Ctrl组相比，SKI/Ctrl组生存率低，主动脉瘤更为严重。SKI/Ctrl组的小鼠死亡率、主动脉瘤发生率、瘤体数目、主动脉瘤破裂比例、弹性蛋白降解程度、瘤体扩张和胶原沉积增加，这些指标在SKI/PIOG组都得到明显改善，且恢复到与WT/Ctrl组相似的水平。表明C674失活加剧AngⅡ诱导的主动脉瘤，而PIOG可以减轻C674失活对主动脉瘤进程的调控。