研究背景支气管哮喘,是世界范围内常见的疾病之一,是变应原诱发的以气道炎症、气道高反应性和可逆性气流受阻为特征的一种慢性呼吸道疾病。据世界卫生组织统计,全世界每年约有1500万人因哮喘失去劳动能力,患者及社会为控制哮喘付出了巨大的费用,给社会带来了巨大的经济负担。因此,对于哮喘的发病机制及其防治的研究,是国内外医学界关注的热点。哮喘的发病机制至今尚未完全清楚,其本质是与免疫、神经、内分泌及遗传等多种因素都密切相关的一种气道慢性炎症。目前,获得性免疫反应机制在哮喘发病中的重要作用已被为多数学者所接受,与其相关研究也已经比较成熟。经典的哮喘发病理论认为机体接触过敏原后,通过抗原呈递细胞,将免疫信号传递给辅助性T淋巴细胞(Th细胞),使得辅助性T细胞0(Th0细胞)向辅助性T细胞2(Th2细胞)分化,导致白介素4(Interleukin, IL-4)等相关因子分泌增多,从而导致Thl/Th2细胞比例失衡。Th2细胞过度活化可以促进B淋巴细胞分泌多种炎症因子,刺激嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞成熟,进一步刺激多种炎症介质产生,从而导致气道炎症的发生。但是,近年来研究发现导致Thl/Th2细胞比例失衡的另一个重要原因是由于哮喘患者自身对过敏原存在免疫调节机制的缺陷,使得固有免疫系统在哮喘发病中的作用地位受到了重视。调节性T细胞(Treg细胞)是固有免疫组成细胞之一,它能够通过多种机制诱导机体对自身抗原和过敏原产生免疫耐受,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞作用最为明显。有研究发现,重症哮喘患者体内Treg细胞的表达减弱,通过卡介苗能够上调哮喘大鼠模型外周血和淋巴液中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量,增强免疫抑制效应,从而发挥抑制气道炎症的作用。血红素加氧酶也被证实可以通过诱导CD4+CD25+Treg细胞特异性转录因子Foxp3的表达,激活CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,以拮抗哮喘气道炎症。髓源抑制性细胞(Myeloid-derived Suppressor Cell, MDSCs)主要是处于分化早期的一群异质性的髓系细胞,其对固有免疫和获得性免疫均具有较强的调节能力。在病理环境下,髓源抑制性细胞可以通过精氨酸酶和诱导型一氧化氮合酶激活发挥免疫调节作用。研究发现该群细胞除了通过髓样分化基因88(Myeloid differentiation primary response gene, MyD88)和Toll样受体7(Toll like receptor,TLR7)途径调节体内T辅助细胞的分化,还可以通过分泌IL-10调节Thl/Th2细胞平衡。近年来,研究还证实该群细胞可以通过诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞产生,从而对机体的固有免疫系统发挥调节作用。该群细胞最早发现于肿瘤患者体内,对肿瘤的免疫调节发挥重要作用,为了确定这样一群异质性细胞,到目前为止,已经进行了10种不同肿瘤模型的研究,每种模型中髓源抑制性细胞数量均较对照组模型显著增加,而且不同模型中还存很多差异。在小鼠体内,髓源抑制性细胞的表面标志通常为CD11b和Gr-1,Gr-1还可进一步分为Ly6G和Ly6C。因为小鼠品系和疾病类型的不同,有些髓源抑制性细胞仅表达CD11b或Gr-1。在早期的研究中,依据髓源抑制性细胞表面标志物的不同,主要将其划分为表达CD11b+Ly6G+Ly6Clow的粒细胞型和CD11b+Ly6G-Ly6Chigh的单核细胞型。随后的研究发现这两种亚型的髓源抑制性细胞在肿瘤、感染以及自身免疫性疾病的作用和机制都是不同的。单核细胞型髓源抑制性细胞主要通过一氧化氮(Nitric oxide, NO)抑制T细胞增殖,而粒细胞型髓源抑制性细胞产生NO的水平较低,不能抑制T细胞增殖。随着研究的不断深入,对于髓源抑制性细胞亚型的鉴定也成为可能,并发现了CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD11b+Ly6G-Ly6+CD11b+Ly6G+Ly6C-等许多新的亚型,但这些亚型对机体免疫系统的具体调节作用仍然未完全明确。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),也被称为内毒素,是革兰阴性细菌细胞壁的主要组成成分之一,作为具有高度保守结构的病原相关分子模式,在细胞内信号传导中充当TLRs信号转导分子的配体,该配体被识别后迁移至外周,导致未成熟髓样细胞分化成熟受阻,从而诱导髓源抑制性细胞的产生。我们前期的研究中已经证实通过腹腔注射脂多糖的方法可以诱导CD11b+Gr-1+髓源抑制性细胞产生,并发现将脂多糖诱导的髓源抑制性细胞由尾静脉过继转移至哮喘小鼠体内,对哮喘小鼠气道炎症具有明显的缓解作用。但是,由于当时实验时间周期较短的限制,未能进一步观察其它亚型髓源抑制性细胞对哮喘气道炎症的影响。本实验拟通过观察脂多糖对哮喘小鼠气道炎症、气道高反应性及气道重塑的不同影响,进一步观察脂多糖干预后哮喘小鼠体内髓源抑制性细胞各亚型变化,并通过检测哮喘小鼠外周Th1/Th2细胞比例,CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,肺组织内iNOS表达及肺泡灌洗液中NO的含量,探讨不同亚型髓源抑制性细胞影响哮喘的可能机制。第一部分脂多糖对哮喘小鼠气道炎症、气道高反应性及气道重塑的影响目的：探讨不同浓度大肠埃希杆菌脂多糖在哮喘小鼠造模不同时期影响哮喘气道炎症、气道高反应性及气道重塑的机制。方法：SPF级BALB/c小鼠48只,随机分为哮喘组、对照组、LPS组(致敏前组,包括l00ng组和l0μg组；诱发前组,包括100ng组和l0μg组；诱发后组,包括100ng组和10μg组),每组6只。哮喘组和LPS组予以卵蛋白溶液致敏和诱发建立哮喘模型,对照组采用生理盐水代替。LPS组在致敏前、诱发前和诱发后分别予100ng或10μg脂多糖腹腔注射。造模结束后,用无创肺功能检测气道反应性(Penh值)的变化。观察肺组织病理改变并运用MGE.J图象分析软件评估气道重塑；计数肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞总数及中性粒细胞(N%)、嗜酸性粒细胞(EOS%)、淋巴细胞百分比；免疫组化观察肺组织内iNOS表达；酶联免疫吸附法检测(ELISA)肺泡灌洗液中IL-4、NO含量评估气道炎症。结果：1.无创肺功能检测：Penh值结果显示,从基线值到乙酰甲胆碱浓度为3.125mg/ml时,正常对照组、哮喘组、LPS组Penh值无明显差异(均P>0.05)。从6.25mg/ml浓度开始,与哮喘组比较,对照组、100ng致敏前组、10gg致敏前组、100ng诱发后组以及10μg诱发后组Penh值明显下降(P<0.05),而100ng诱发前组和10μg诱发前组Penh值无显著差异(P>0.05)；与对照组比较,LPS各组Penh值升高(P<0.05)；LPS各浓度间比较,同一时间段不同浓度两组间比较无显著差异(P>0.05)。2.BALF中细胞计数：哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数以及中性粒细胞百分比(N%)、嗜酸性粒细胞百分(E%)比与对照组比较明显增多(P<0.05)。与哮喘组比较,100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组炎症细胞总数以及N%、E%明显降低(P<0.05),但较对照组仍有升高(P<0.05),三组间差异无统计学意义(P>0.05)；而10μg致敏前组、诱发前组100ng和10gg诱发前组炎症细胞总数以及N%均较哮喘组增高(P<0.05),E%无明显差异(P>0.05),三组间差异亦无统计学意义(P>0.05)；对照组、哮喘组、LPS各组间淋巴细胞百分百均无明显差异(均P>0.05)。3.肺组织病理学变化：对照组小鼠肺组织结构清晰,基本无炎症细胞浸润；哮喘组小鼠支气管周围有炎症细胞浸润增加,上皮损伤,细胞排列紊乱；100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组病理组织改变均较哮喘组减轻,而10μg致敏前组、100ng诱发后组、10μg诱发后组和哮喘组无明显差异。4.气道重塑评估：哮喘组、LPS组比对照组气道重塑加重(P<0.05)。与哮喘组比较,100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组气道重塑显著减轻(P<0.05)；而10μg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组较哮喘组加重(P<0.05)；100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组组间比较,10μg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组组间比较均无明显差异(P>0.05)。5免疫组化法检测肺组织内iNOS表达：本研究结果显示iNOS表达在哮喘组小鼠肺组织中呈强阳性,而对照组和LPS各组小鼠肺组织内iNOS未见明显表达。6.酶联免疫斑点吸附法检测肺泡灌洗液中NO的含量：哮喘组BALF中NO的含量(9.19±2.54)较对照组(0.67±0.14)显著增高(P<0.05)；而LPS干预的各组小鼠肺泡灌洗液中未检测到NO表达。7. BALF中IL-4含量：与对照组相比,哮喘组以及BALF中IL-4水平升高(P<0.05)；与哮喘组相比,100ng诱发前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组明显降低(P<0.05)；而10μg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组较哮喘组无明显差异(P>0.05)；100ng诱发前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组组间比较,10μg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组组间比较均无明显差异(P>0.05)。结论：1.早期和晚期脂多糖干预可缓解哮喘小鼠气道高反应性。2.早期低剂量(致敏前100ng)和晚期(诱发后100ng或10μg)脂多糖干预可通过下调肺组织内iNOS表达,缓解哮喘气道炎症和气道重塑。3.早期高剂量(致敏前10μg)和诱发阶段(致敏前100ng或10μg)脂多糖将加重气道炎症和气道重塑。第二部分脂多糖诱导髓源抑制性细胞各亚型差异及对哮喘气道影响目的：探讨不同浓度脂多糖对哮喘小鼠脾脏髓源抑制性细胞各亚型的诱导及其对哮喘的影响。方法：具体同第一部分。用流式细胞术检测小鼠脾脏中髓源抑制性细胞各亚型比例,以及外周血中Thl/Th2细胞比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。结果：1.脂多糖诱导脾脏中髓源抑制性细胞亚型的变化：哮喘组和对照组间比较,Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+占CDllb+MDSC比例明显增高,Ly6G+Ly6C+匕例降低(均P<0.05)。与哮喘组比较,100ng诱发前组或10μg诱发前组Ly6G+Ly6C-、Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+增加(均P<0.05),Ly6G+Ly6C+无差异(P>0.05)；100ng致敏前组、100ng诱发后组和10gg诱发后Ly6G+Ly6C-、 Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低(均P<0.05),Ly6G+Ly6C+增加(P<0.05)；10μg致敏前组Ly6G-Ly6C-、Ly6G-Ly6C+降低,Ly6G+Ly6C+增加(均P<0.05),Ly6G+Ly6C-无明显差异(P>0.05)。不同时间段的两组间比较,除致敏前10gg脂多糖干预组Ly6G+Ly6C-,其余各组组间均无明显差异(P>0.05)。2.外周血Thl/Th2细胞检测：哮喘小鼠外周血中Thl/Th2与正常小鼠比较存在显著性偏移(P<0.05)。与哮喘组比较,100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组则Thl/Th2均增大(P<0.05),而10μg致敏前组、100ng诱发前组或10ug诱发前组Thl/Th2差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照比较,100ng诱发后组和10gg诱发后组Thl/Th2均增大(P<0.05),而10gg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组Th1/Th2均减小(P<0.05),100ng诱发前组无明显差异(P>0.05)；不同时间段的两组间比较,除10μg致敏前组,其余各组组间均无明显差异(P>0.05)。3.外周血Treg细胞检测：哮喘小鼠外周血中Treg细胞较正常小鼠降低(P<0.05)。与哮喘组比较,100ng致敏前组、100ng诱发后组和10μg诱发后组CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+阳性比例均增加(P<0.05),10μg致敏前组、100ng诱发前组和10μg诱发前组均无显著差异(P>0.05)；与对照组比较,100ng致敏前组、100ng诱发后和10μg诱发后预组CD4+CD25+Treg、 CD4+CD25+Foxp3+Treg匕例均增加,10gg致敏前组、100ng诱发后组和10gg诱发后组比例均降低(均P<0.05)。不同时间段的两组间比较,均无明显差异(P>0.05)。结论：1.早期低剂量(致敏前100ng)和晚期(诱发后100ng或10μg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G+Ly6C+亚型分化,缓解哮喘小鼠气道炎症。2.早期高剂量(致敏前10μg)和诱发阶段(诱发前100ng或1Oμg)脂多糖可刺激CD11b+Ly6G-Ly6C-、CD11b+Ly6G+Ly6C-、CD11b+Ly6G-Ly6C+亚型分化加重哮喘小鼠气道炎症。3.脂多糖诱导髓源抑制性细胞亚型变化,可能是调节哮喘固有免疫和获得性免疫的关键环节。