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凝血障碍是导致出血性疾病的重要原因，凝血过程的激活在血栓形成中也具有极为重要的作用。本研究通过对部分凝血因子的基因突变和多态性研究，一方面探讨了遗传出血性疾病血友病A和FⅫⅠ缺乏症的分子机制，另一方面研究了凝血因子Ⅱ、Ⅴ和ⅫⅠ的多态FⅡ20210A、FⅤLeiden和FⅫⅠ-A V34L在加拿大纽芬兰人群和中国台湾人群中的分布频率以及与心肌梗死发病的相关性。 血友病A(hemophilia A)是最为常见的遗传性出血性疾病，发病率约为1／5000男性，为X连锁隐性遗传。已发现FⅧ基因的缺陷种类800多种。 先天性凝血因子ⅫⅠ缺乏症(Congenital Factor ⅫⅠ Deficiency)是一种少见但严重的常染色体隐性遗传的出血疾病，绝大多数是由于FⅫⅠA亚单位缺陷导致的。FⅫⅠ缺乏症是高度的遗传异质性疾病，全世界有200多例报告，共计突变类型47种。 心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠心病的结局之一。在这一发病过程中，冠状内血栓形成对MI的发生发展起重要作用。 Factor V Leiden(FVL，FV R506Q)和凝血酶原20210G＞A(FⅡ 20210G＞A)的变异是两个普遍认为的静脉血栓形成的遗传促凝血高危因子。这两个基因的变异是否与MI发生中的动脉血栓形成相关也得到了人们的关注，而另一普遍的基因变异FⅫⅠ-AVal34Leu被认为可能起到预防MI的作用，但也有相反的报告。 加拿大纽芬兰和拉博道省(Newfoundland& Labrador)所在岛屿位于加拿大东海岸，岛上人群主要来自17与18世纪英国和爱尔兰移民的后裔。由于该岛地理与社会的隔离使得几百年来很少内部迁徙，从而导致岛内人群遗传隔离。 我们发现在纽芬兰和拉博道省偏远地区Twilligate和Forteau有高发的轻型血友郑州大学博士研究生论文遗传性出血疾病与血栓相关疾病的分子生物学研究病A，这些患者的家族史使我们可以把Twilligate的所有患者联系在一个跨越10代的包括1630个家族成员的大家族，而Forteau的患者则联系在一个跨越6代的约567个成员的家族。在Twilligate中发病为约44/3 300男性，在Forteau发病为约14/260男性。 我们还发现在纽芬兰和拉博道省FXlll缺乏症的发病率在全加拿大最高。己经确认了来自3个家庭的5个患者。 该人群的高发轻型血友病A和FXlll缺乏症极大可能来自一个或很少几个方德突变(founder mutation)。对此进行研究将有助于对患者早期诊断、治疗及精确检出表型正常的高危携带者，对改善当地人群的身体健康有着重大的临床意义。 作为一多因素疾病，Ml的遗传基础可能是一系列基因的联合作用，一般进行基因与基因间相互作用的研究中常遇到的问题是相对样本量较小，基因变异频率低，调查人群的种族异质性等。为克服这些弱点，我们在遗传隔离的纽芬兰人群中选取500MI患者和500正常个体同时进行FVL、Fll 20210G)A和FXlll一A、乞134Leu的研究。 FVLe记en、Fll20210G>A和FXHI~AV34L的发生存在着世界性的地理异质性和种族差异分布，为确定其在中国人群中的分布，我们对取自中国台湾的较大样本(500)进行FVL、Fll ZOZ10G>A和Fxm一A Leu34基因型频率和基因频率的研究，并与加拿大纽芬兰高加索人群的分布频率进行比较，为进一步对其与血栓形成的相关性研究提供理论依据。方法:我们从Twilligate群体中选择采集了36份血样，另外还有4名明显无亲缘关系的周围50英里外的英国伦敦的轻型血友病患者的血样。随后，又在当地人群采集了部分血样进行筛查，先后共检测基因组DNA94份，包括患者36人，携带者29人，正常29人。在纽芬兰省其他地区随机选取了包括67条X染色体的正常人基因组DNA。 我们亦从Forteau人群中选择采取了4份血样，包括患者2人，肯定携带者1人，可疑携带者1人。 在FXm缺乏症的研究中，我们采集了经临床确诊为FXlll缺乏症的来自三个家庭的5名患者的血样。 在血友病A的研究中，以高盐法提取基因组DNA。PCR引物设计为扩增全部FVnl基因编码区、剪接位点和5’、3‘非编码区。应用构象敏感凝胶电泳(CSGE)和突变检出强化(MDETM)电泳对两名患者的所有PcR产物进行异二倍性分析的突郑州大学博士研究生论文遗传性出血疾病与血栓相关疾病的分子生物学研究变筛查，对显示突变带的部分进行测序。应用MDETM结合位点特异PcR(AsP)对确认突变进行群体普查。 在FXnl缺乏症的研究中，PCR引物设计为扩增全部FXmA基因编码区和剪接位点。应用MDETM电泳对5名患者的所有PcR产物进行异二倍性分析的突变筛查，接着对所有巧个外显子的PCR产物进行了直接测序。应用TSP509I酶切进行了突变验证。 在基因多态与血栓的相关性研究中，应用复合PCR扩增法同时扩增FV基因第5外显子和Fll基因第14外显子及3‘非翻译区，限制性内切酶Hind 111和Mnll双消化，PCR扩增FXm第2外显子，限制性内切酶Ddel消化，10%聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，EB染色。结果:对两名来自Twilligate的患者的csGE分析和MDETM胶分析均显示Fvin基因第19外显子有突变带。测序结果显示在ni6047位有一T~C转换，相应于第2016密码子，导致蛋白质此位点的撷氨酸(GTG)被丙氨酸(GcG)替换。?