第一部分 人脐带间充质干细胞来源微泡的生物学特征目的:明确人脐带间充质干细胞来源微泡(MSC-MVs)的形态结构、尺寸分布和免疫表型等一般生物学特征;比较脐带MSC-MVs和成人骨髓MSC-MVs的miRNAs表达差异,明确脐带MSC-MVs的miRNAs表达特征。方法:培养并鉴定脐带来源MSCs;采用差速离心的方法获取MSCs培养上清中的MSC-MVs;透射电镜及激光共聚焦显微镜观察其形态结构特征;qNano-TRPS检测其尺寸分布特征;流式细胞术检测MSC-MVs表面抗原的表达情况;RNA-seq和small RNA-seq分析比较脐带MSC-MVs与成人骨髓MSC-MVs中mRNAs和miRNAs的表达特征。结果:组织块法获得的人脐带MSCs具有MSCs表面抗原的表达特征,并具有成骨、成脂多向分化潜能。差速离心法提取的MSC-MVs是直径小于1μm,主峰位于200-500nm之间,具有膜结构的球形小体。流式结果显示,MSC-MVs表达其母体细胞的膜表面抗原表达特征。对脐带MSC-MVs和成人BMSC-MVs中mRNAs进行信号通路富集分析发现,脐带MSC-MVs中所表达的基因主要富集于促进转录和细胞周期相关信号通路,而成人骨髓MSC-MVs中所表达的基因主要富集于负向调控蛋白质组装以及应激应答相关的信号通路。脐带MSC-MVs的RNA成分中,miRNAs所占的比例最高,并且其miRNA的表达量要明显高于成人骨髓MSC-MVs。结论:人脐带MSCs在体外培养过程中能够产生大量的MVs,MSC-MVs主要分布于200-500nm之间,并具有类似于其母细胞的抗原表达特征。与成人骨髓MSC-MVs比较发现,脐带MSC-MVs携带“年轻的RNA分子信息”。miRNAs是脐带MSC-MVs的RNA组分中最为关键的组成部分,并且其表达量明显高于成人骨髓MSC-MVs,极有可能是其发挥生物学作用的关键效应分子。第二部分基于微泡识别间充质干细胞衰老的研究目的:阐明不同衰老程度MSCs分泌MVs能力变化、MSC-MVs表型及功能特征的改变;明确不同衰老程度MSC-MVs中miRNAs表达差异及规律,鉴定出能够反映MSCs衰老状态的标志性miRNAs。方法:体外培养不同衰老程度的脐带MSCs,通过qNano-TRPS检测MSCs分泌MVs能力,以及MSC-MVs尺寸分布特征的改变;流式细胞术检测MSC-MVs表面抗原表达的变化;通过qRT-PCR和茜素红染色,比较早、晚代MSC-MVs促MSCs成骨分化能力的差异;采用高通量测序,分析比较MSCs及MSC-MVs中miRNAs的表达差异及规律;鉴定不同衰老程度MSCs中差异表达的mRNAs和miRNAs,结合GEO数据库中转录因子与靶基因的数据库,构建衰老MSCs的差异miRNAs-TF前反馈环共调控网络,筛选出在MSCs衰老过程中起核心调控作用的关键miRNAs,结合关键miRNAs在不同衰老程度MSCs及MSC-MVs中的表达规律,进一步遴选出MSC-MVs中能反映MSCs衰老状态的标志性miRNAs。结果:衰老MSCs分泌MVs的能力增强,并且其平均尺寸小于早代MSC-MVs。随着MSCs衰老,MSC-MVs表面CD105的阳性率下降。与早代MSC-MVs相比,衰老MSC-MVs促BMSCs成骨分化能力减弱。RNA-seq分析结果表明,随着MSCs衰老,MSCs及MSC-MVs中miRNAs的数量以及表达量均呈现下降的趋势,而且MSC-MVs中miRNAs下调趋势更明显。miR-146a-5p处于MSCs衰老调控网络的核心位置并且随MSCs衰老,其表达量在MSCs和MSC-MVs中均呈逐渐上调的趋势。结论:MSC-MVs是MSCs衰老相关分泌表型(SASP)的重要组成部分,可以从浓度、尺寸分布、免疫表型、促成骨分化功能以及miR-146a-5p的表达量等多个角度动态反映MSCs的衰老状态,有望成为精确反映和动态监视MSCs衰老状态的潜在生物标志物。第三部分脐带间充质干细胞来源微泡逆转间充质干细胞衰老的研究目的:明确脐带MSC-MVs对成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的逆转效应;证实脐带MSC-MVs可以逆转衰老BMSCs的促血管新生能力以及多向分化潜能;探究脐带MSC-MVs逆转成人BMSCs衰老的可能性分子机制。方法:将脐带MSC-MVs与衰老的成人BMSCs共同培养,通过Edu、克隆形成实验检测脐带MSC-MVs对衰老BMSCs增殖能力和自我更新能力的影响。β-半乳糖苷酶染色实验检测脐带MSC-MVs对衰老BMSCs表达β-半乳糖苷酶情况的影响。qRT-PCR 和 Western Blot 检测脐带 MSC-MVs 对衰老 BMSCs 中 P16、P21 和 P53 衰老相关基因表达的影响。qRT-PCR、ELISA和小管形成实验检测脐带MSC-MVs对衰老BMSCs促血管新生能力的影响。通过茜素红染色、裸鼠异位成骨模型等体内、外实验检测脐带MSC-MVs对衰老BMSCs成骨分化能力的影响。qRT-PCR和油红O染色检测脐带MSC-MVs对衰老BMSCs向脂肪细胞分化的影响。茜素红染色比较脐带MSC-MVs、成人骨髓MSC-MVs、新生儿成纤维细胞来源MVs以及Rnase消化后的脐带MSC-MVs对衰老BMSCs成骨分化能力的影响。高通量测序比较脐带MSC-MVs、成人骨髓MSC-MVs以及新生儿成纤维细胞来源MVs中miRNAs的表达差异。结果:脐带MSC-MVs能够促进衰老BMSCs的增殖和自我更新能力,降低衰老相关β-gal的活性,抑制P16、P21和P53衰老相关基因的表达。通过qRT-PCR、ELISA和小管形成实验证实脐带MSC-MVs可增强衰老BMSCs的促血管新生能力。体内、外实验证实脐带MSC-MVs可以增强衰老BMSCs的成骨分化功能。qRT-PCR和油红O染色证实脐带MSC-MVs可以抑制衰老BMSCs的成脂分化能力。茜素红染色表明脐带MSC-MVs促衰老BMSCs成骨分化的能力强于成人骨髓MSC-MVs和新生儿成纤维细胞来源的MVs。Rnase消化实验和mIRNA-seq结果分析表明脐带MSC-MVs逆转衰老BMSCs成骨分化效应的关键效应分子极有可能是miRNAs。结论:脐带MSC-MVs可以逆转成人BMSCs的衰老状态,增强衰老BMSCs的促血管新生能力、成骨分化能力,并抑制衰老BMSCs向脂肪细胞分化。脐带MSC-MVs对衰老BMSCs的逆转效应极有可能是通过水平传递miRNAs实现的。这一研究不仅为体外逆转BMSCs的衰老提供了一种新方法,也为治疗机体MSCs的衰老以及MSCs衰老相关疾病提供了新的策略和思路。