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脑胶质瘤是最常见和棘手的中枢神经系统原发性肿瘤[1]，2/3以上为恶性胶质瘤。即使采用现代综合治疗手段，恶性胶质母细胞瘤的预后没有得到明显改善，病人的中位生存期为15-17个月[2][3]。肿瘤的高度侵袭性、神经系统破坏能力和向周围正常脑组织弥漫浸润生长的特性是胶质瘤复发的根本原因[4]。胶质瘤的侵袭和迀移特性阻碍了胶质瘤的传统治疗效果[5]。因此需要研究其发病机制，开拓新的治疗途径。然而，遗传学研究的最新进展正在探索与胶质瘤发生、发展相关的基因、信号通路及分子机制，基因疗法已经成为一种新的治疗策略。 IKBKE亦称为IKKε或IKK-i，是IKK家族成员[6,7]。在研究中发现IKBKE在乳腺癌[8,9]、卵巢癌[10]和前列腺癌[11]中激活并高表达。这些研究同样显示IKBKE可以促进细胞的生存、生长并降低细胞对化疗的敏感性[10,12,13]，并且IKBKE的高表达导致胶质瘤细胞的恶性迀移[9,14]。我实验室的前期研究表明IKBKE在人胶质瘤细胞中高表达，用siRNA抑制IKBKE的表达可以显著抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖能力[15]。 近年的研究表明，人脑胶质瘤呈现微小RNA的异常表达，其中包括let-7[16][17]。miRNA是一种长度约为22nt的非编码单链小分子RNA，与靶基因3’非转录区域(3’UTR)特异性结合，使靶基因降解或抑制其翻译，进而对基因进行转录后调控[18-24]。miRNA在细胞生长、分化、凋亡、增殖中发挥重要作用[25-27]。 Let-7家族在功能和序列上高度保守。Let-7家族作为肿瘤抑制因子能够抑制致癌基因和一些信号通路的关键基因，例如：HMGA2、MYC、RAS[28]研究表明，通过Ras途径，let-7家族能够降低GBM细胞的生长和迀移能力[16,29,30]。目前，一些数据间接表明胶质瘤的不良预后和let-7低表达之间有关联，但没有数据显示let-7在人胶质瘤中低表达[31,32]。然而，生物信息学分析显示，IKBKE是microRNAs let-7b/i的靶基因。因此，let-7b/i可能是治疗胶质瘤的新靶点。故本课题研究miR-let-7b和miR-let-7i直接作用于IKBKE对胶质瘤细胞系U251和 U87在迀移和侵袭方面的影响，探索并验证可能存在的信号通路，为未来胶质瘤的临床治疗提供实验依据。 本课题研究分为以下两个部分： 第一部分为let-7b/i在胶质瘤中的表达及对IKBKE的靶向调控。应用实时定量PCR(real time-PCR, RT-PCR)的方法，我们检测了3例正常脑组织和2个胶质瘤细胞系中let-7b/i的表达水平；采用Target Scan6.2、microRNA-Targets and Expression来寻找IKBKE的上游调控基因；应用寡核苷酸let-7b/i mimics转染2个胶质瘤细胞系，并通过RT-PCR检测let-7b/i的表达效果；应用Western blot检测转染let-7b/i mimics后目标基因的表达变化；应用荧光素酶报告试验验证IKBKE的上游调控基因。结果表明let-7b/i的表达在胶质瘤中较正常组织显著下降；Target Scan6.2分析显示99个miRNAs和IKBKE存在直接相关性， microRNA-Targets and Expression分析显示存在25个 miRNAs和IKBKE存在直接相关性。TargetScan6.2显示let-7b、let-7i与基因IKBKE之间有更强的结合力，因此IKBKE可能为let-7b/i的靶基因。转染let-7b/i mimics后肿瘤细胞let-7b/i表达明显升高，IKBKE表达量降低。荧光素酶实验显不与control组、scramble组及pZEX-IKBKE-3UTR-Mut组比较，共转染let-7b/i mimics和pZEX-IKBKE-3UTR-wild质粒时荧光强度显著增高。故可推断let-7b/i直接靶向IKBKE。 第二部分为let-7b/i通过IKBKE/E-cadherin通路调控细胞的侵袭和迁移。采用划痕试验、侵袭试验检测转染let-7b/i mimics后胶质瘤细胞的迀移和侵袭能力；体外应用RNA干涉技术以oligofectamine介导siRNA靶向IKBKE转染人脑胶质母细胞瘤U87和U251细胞后，应用蛋白印迹检测目的蛋白表达。结果显示，转染let-7b/i mimics后胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力下降；应用RNA干涉技术以oligofectamine介导转染靶向 IKBKE siRNA后，IKBKE表达下调，E-cadherin表达升高，与第一部分的实验研究发现转染let-7b/i mimics后肿瘤细胞IKBKE表达下降，E-cadherin表达升高相一致。这些数据表明let-7b/i很可能通过IKBKE/E-cadherin通路调控细胞的侵袭和迁移。 结论：let-7b/i在胶质瘤细胞系中低表达，通过生物信息学分析，蛋白免疫印迹检测和荧光素酶实验，我们证实let-7b/i为IKBKE的上游调控基因。通过体外实验的研究，我们发现let-7b/i过表达使得IKBKE相关通路上的E-cadherin表达量明显上升。这些数据表明：let-7b/i很可能通过IKBKE基因调控IKBKE/ E-cadherin通路，调控细胞的侵袭和迁移。