大脑内复杂的神经网络是由庞大数量的神经元通过突触连接形成的。神经元之间信息的传递与处理,是大脑认知和记忆的功能基础。活体成像技术,结合功能标记来记录神经元动态活动,已经成为了脑功能研究的主要方法之一。而颅窗方法,解决了颅骨不透明等问题,为直接观察皮层神经活动提供了技术支撑。但是,颅窗方法还存在着固定不稳和颅窗不密闭等问题,这些问题阻碍了对清醒动物成像的研究。具体的说,第一,小鼠头部固定问题。实验中人们通常使用固定杆或固定片固定小鼠头部,但颅骨表面剩余的软组织会导致固定装置与软组织的接触面不稳。当清醒小鼠活动时,这种不稳定性会造成固定装置机械稳定性降低。同时,头部固定机械结构的稳定性不足也会引发成像环节的焦平面晃动,甚至机械结构脱落。第二,颅窗的密闭问题。颅窗手术中,常用胶水黏合的方法来封闭玻璃片和颅骨之间的缝隙,这种方法因颅窗密闭性不强,而导致胶水进入颅腔内部和引发脑部炎症等现象,这不仅破坏了颅窗内的生理环境,而且会遮挡甚至覆盖目标区域。这些问题影响了清醒小鼠的功能成像效果,导致了长时观测的稳定性差和成功率低。针对上述问题,本文建立了一种用于清醒小鼠双光子成像的颅窗方法。通过改进固定方式提升了固定装置机械稳定性,优化手术步骤增强了颅窗的密闭性并减少了炎症的发生,从而成功的实现了清醒小鼠皮层神经元功能信号的长时稳定观察。首先,通过新型的头部固定装置并基于该固定装置的机械结构处理颅骨表面大量存在的软组织,将固定装置和已清除软组织的刚性颅骨牢固地连接在一起,保证了长时间的高机械稳定性。其次,通过使用颅窗玻璃和钛环的组合部件避免胶水与玻璃的直接接触;根据颅窗玻璃的尺寸大小制作颅窗模具,精准把握颅窗尺寸;在颅窗玻璃安装过程中使用加工制作的固定支架对颅窗玻璃进行定位和压紧,实现了颅窗玻璃与颅骨的高密闭性,从而避免了胶水进入颅腔和炎症的发生。最终实现了对清醒小鼠脑部的长时程功能成像。使用上述头部固定和颅窗手术的优化方法,我们实施了不同品系的转基因小鼠的颅窗手术,并对术后14天的小鼠皮层神经元进行了活体成像。对清醒状态小鼠,清晰地观察到位于皮层350μm深度的神经元胞体和树突结构,这证实了该方法具有较好的机械稳定性和颅窗透光性。同时,我们还将该方案运用到了神经元功能研究中。以小鼠运动视觉为模型,在术后10天和57天分别对神经元胞体进行观测,并且当给予视觉刺激时,可稳定记录到钙响应信号。本文完善了颅窗手术方法,建立了完整的颅窗手术方案,并基于该方案可对神经元功能信号的长时程记录。本方法的建立,提供了一种完善的颅窗手术方案,解决了成像过程中清醒小鼠的抖动和颅窗内部炎症组织对信号的遮挡问题,提高了清醒小鼠神经元成像的成功率,为神经活动的长时稳定记录提供了技术支撑,对于探索神经环路功能,进而理解大脑复杂行为背后的神经机制有重大意义。