猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)是引起猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)的主要病原体。2周龄以内仔猪感染强毒力TGEV会发生剧烈呕吐、急性肠绒毛萎缩,严重的吸收不良性腹泻和脱水,死亡率高达100%,而5周龄以上的猪只感染发病后可逐渐痊愈,但其免疫功能受到损伤,极易产生继发病毒或细菌感染。2周龄以内仔猪感染TGEV弱毒株仅仅产生轻微的临床症状和极低的死亡率,而其它年龄的猪只感染并不发病。猪小肠上皮细胞是TGEV感染的主要靶细胞,猪小肠上皮细胞下分布大量的树突状细胞,后者作为抗原递呈能力最强的免疫细胞,在防御病毒入侵和诱导机体产生抗病毒免疫应答中发挥重要作用。本试验以猪小肠上皮细胞空肠系(Porcine small intestinal epithelial cell line-jejunum 2, IPEC-J2)和猪单核源树突状细胞(Monocyte derived dendritic cells, Mo-DCs)作为TGEV感染对象,通过研究TGEV强毒力(SHXB)和弱毒力(sTc3)毒株与这两种细胞的相互作用,来探讨TGEV强弱毒株感染引起仔猪不同发病率和致死率的致病机制。1 TGEV强弱毒株对IPEC-J2细胞易感性的研究为了研究TGEV强弱毒株是否感染IPEC-J2细胞,我们首先采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化TGEV强毒株(SHXB)和弱毒株(STC3)；然后应用直接免疫荧光、病毒滴度、流式细胞术等方法检测TGEV强弱毒株对IPEC-J2细胞的易感性；最后通过扫描电镜和透射电镜观察TGEV强弱毒株感染造成IPEC-J2细胞的病理损伤情况。结果显示：纯化的TGEV强毒株(SHXB)和弱毒株(STC3)病毒粒子形态没有显著差异,两者均呈圆形或椭圆形,纤突长而稀疏,有一个电子透明中心；TGEV强弱毒株均可以感染IPEC-J2细胞,但强毒株在IPEC-J2细胞的复制量高于弱毒株p<0.05)；TGEV强毒株导致IPEC-J2细胞发生严重病变,广泛引起细胞微绒毛散乱、脱落、部分膨大形成蘑菇状,细胞微丝骨架散乱、消失,细胞内部线粒体、高尔基体、内质网等双层膜结构消失而出现空泡状或U型的单层膜结构,细胞核周池变大、内外核膜分离、核固缩。而TGEV弱毒株感染仅引起IPEC-J2细胞发生轻微病变,仅见细胞微绒毛散乱、少量形成膨大的蘑菇状结构,细胞内部线粒体、高尔基体、内质网等肿胀,细胞核周池稍微膨大、部分细胞内外核膜分离。本试验表明TGEV强弱毒株均可以感染IPEC-J2细胞,但强毒株在IPEC-J2细胞的复制量显著高于弱毒株,且对IPEC-J2细胞造成的病理损伤也比弱毒株严重。2 TGEV强弱毒株对IPEC-J2细胞紧密连接和微丝骨架的影响紧密连接是肠上皮细胞之间的主要连接方式之一,对维持上皮细胞完整性以及防止细菌、病毒等病原体进入体内起着重要的作用。病毒和细菌能通过改变细胞的微丝骨架使自己的增殖达到最佳水平,故细胞微丝骨架与病原体感染存在密切的关系。为了研究TGEV强弱毒株对IPEC-J2细胞紧密连接和微丝骨架的破坏作用,本试验首先通过细胞跨膜电阻变化试验、葡聚糖渗透性试验和Western Blot检测。TGEV强毒弱毒株对IPEC-J2细胞紧密连接完整性的破坏情况以及对紧密连接蛋白表达量的影响；然后通过免疫荧光(FITC-phalloidin染色)和透射电镜观察TGEV强弱毒株对IPEC-J2细胞的微丝骨架重塑的影响,并用微丝稳定剂(Jas)和细胞松弛素D(Cyto D)人为改变细胞微丝状态,通过检测细胞内病毒的TCID50研究解聚的或稳定的微丝结构对病毒的入侵、复制和释放的影响；最后本试验采用流式细胞术检测TGEV强弱毒株感染IPEC-J2细胞MAPK信号通路(MAPK信号通路在调控细胞紧密连接的变化以及微丝的重塑中发挥重要作用)中的三种重要亚族ERK、JNK和p38的活化情况,进一步解释TGEV强弱毒株可能是通过激活IPEC-J2细胞MAPK信号通路来调控其破坏IPEC-J2细胞紧密连接完整性和引起微丝骨架重塑。结果显示：TGEV强弱毒株在感染早期均可以降低IPEC-J2细胞跨膜电阻,增加细胞旁路渗透性,下调IPEC-J2细胞的紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达,且TGEV强毒株对IPEC-J2细胞紧密连接完整性的破坏程度显著高于弱毒株(p<0.05); TGEV强弱毒株均可以引起IPEC-J2细胞微丝重塑,而TGEV强毒株引起IPEC-J2细胞微丝骨架发生紊乱的程度显著高于弱毒株,人为用CytoD/Jas来解聚/稳定微丝结构,均可以降低TGEV强弱毒株的复制和释放,并且可显著抑制TGEV强毒株的复制和释放(p<0.05)；最后发现TGEV强毒株感染1 h均可以激活IPEC-J2细胞MAPK信号通路的ERK1/2和JNK蛋白,而TGEV强毒株感染24 h可以显著激活JNK蛋白,并抑制ERK1/2和p38蛋白的激活p<0.05),弱毒株感染24 h仅抑制ERK1/2蛋白的激活。本试验表明TGEV强弱毒株在感染早期可以破坏IPEC-J2细胞的紧密连接完整性,在整个感染期可以调控微丝重塑以利于自己的复制,这些可能与MAPK信号通路的参与有关。TGEV强毒株对IPEC-J2细胞紧密连接完整性的破坏、对细胞微丝重塑的影响以及对细胞MAPK信号通路蛋白激活的程度显著高于弱毒株,这可能与TGEV强毒株造成靶细胞严重破坏有关。3 TGEV强弱毒株对体外培养的猪单核源树突状细胞免疫功能的影响树突状细胞是功能最强大的抗原递呈细胞,广泛分布于肠上皮细胞下,其对从黏膜部位入侵的病原体发挥着免疫识别、免疫应答和免疫调控等重要作用。为了进一步研究TGEV强弱毒株与猪树突状细胞之间的相互作用,本试验首先体外诱导猪外周血单核细胞分化为单核源树突状状细胞(Mo-DCs);再将Mo-DCs与TGEV强弱毒株感染的IPEC-J2细胞共培养,研究Mo-DCs跨IPEC-J2细胞紧密连接摄取TGEV的能力：然后通过绝对荧光定量、病毒滴度、流式细胞术等检测TGEV强弱毒株对Mo-DCs细胞的易感性；再分别用流式细胞术和ELISA检测TGEV强弱毒株对Mo-DCs细胞表型分子表达和细胞因子分泌情况的影响,最后通过混合淋巴反应试验检测TGEV强弱毒株感染的Mo-DCs刺激T、细胞增殖的能力。结果显示：本研究成功诱导培养出高纯度的Mo-DCs; Mo-DCs可以伸出树突来摄取TGEV强弱毒株,对TGEV强毒株(SHXB)的摄取能力随时间增长而降低(p<0.05),而对弱毒株的摄取能力随时间增长而增强(p<0.05); TGEV强弱毒株均可以低水平感染未成熟和成熟Mo-DCs,且未成熟Mo-DCs比成熟Mo-DCs更易感；与对照组相比,TGEV强毒株感染导致未成熟和成熟Mo-DCs表面分子CDla+、SLA-II-DR+表达量显著下降(p<o.05),而弱毒株感染后几乎不影响它们的表达量；TGEV强毒株感染导致未成熟Mo-DCs分泌IL-12和IFN-γ的数量显著低于弱毒株感染p<0.05),但TGEV强弱毒株均不影响未成熟和成熟Mo-DCs分泌IL-10 (p>0.05); TGEV强毒株感染的未成熟和成熟Mo-DCs均失去刺激T细胞增殖的能力,而弱毒株感染的未成熟和成熟Mo-DCs在一定程度上可以刺激T细胞增殖。这些结果说明TGEV强弱毒株可以影响Mo-DCs的抗原摄取、递呈、分泌细胞因子以及刺激T细胞增殖的能力,但TGEV强毒株严重损伤Mo-DCs的这些功能而TGEV弱毒株可以增强Mo-DCs的功能。4 TGEV强弱毒株对仔猪体内空肠树突状细胞免疫功能的影响为了在体内进一步验证TGEV强毒株损伤猪树突状细胞的抗原摄取和递呈功能,而弱毒株增强猪树突状细胞的免疫功能。首先,本试验通过肠结扎手术向仔猪空肠肠腔注射TGEV强弱毒株,用免疫荧光和免疫组化法检测注射TGEV强弱毒株不同时间仔猪空肠绒毛和固有层CD11b+ CD16+ DCs、SWC3a+ SLA-II-DR+ DCs、CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量变化情况来研究猪树突状细胞对TGEV强弱毒株的抗原摄取和递呈功能的变化。结果显示：在TGEV强毒株感染早期(15 min-3 h),仔猪空肠绒毛CDllb+CD16+DCs和SWC3a+ SLA-II-DR+DCs迅速增多,绒毛CD3+、CD4+和CD8+T细胞也迅速增加。随着感染时间增长(48 h),仔猪空肠绒毛和固有层DCs显著降低60<0.05),这些部位CD3+、CD4+和CD8+T细胞也显著减少(p<0.05)。而在TGEV弱毒株感染早期(15 min-3 h),仔猪空肠绒毛CDllb+ CD16+ DCs和SWC3a+SLA-II-DR+ DCs和绒毛CD3+, CD4+和CD8+T细胞数量变化不显著(p>0.05),但随着感染时间增长(48 h),仔猪空肠绒毛和固有层DCs显著增多p<o.05),同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞也显著增多p<0.05)。上述结果说明仔猪受到TGEV强毒株感染时,肠道DCs对其抗原摄取和递呈能力随时间增长而降低,而仔猪受到TGEV弱毒株感染时,肠道DCs对其抗原递呈能力随时间增长而增强。为了进一步研究TGEV强弱毒株对体内树突状细胞抗原递呈功能的影响,本试验给仔猪饲喂TGEV强弱毒株48 h后,通过肠结扎手术向仔猪肠腔注射灭活的大肠杆菌K88(模式抗原),用免疫荧光和免疫组化法检测注射模式抗原不同时间仔猪空肠绒毛和固有层CDllb+ CD16+ DCs、SWC3a+ SLA-II-DR+ DCs、CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量变化情况。结果显示：仔猪感染TGEV强毒株48 h再次注射灭活的大肠杆菌K88后15 min-3 h,仔猪空肠绒毛和固有层CD11b+ CD16+ DCs和SWC3a+ SLA-II-DR+ DCs数量几乎没有增加,绒毛和固有层CD3+、CD4+和CD8+T细胞也没有显著增加。而仔猪感染TGEV弱毒株48 h再次注射灭活的大肠杆菌K8815 min-3 h,仔猪空肠绒毛和固有层CDllb+CD16+ DCs和SWC3a+ SLA-II-DR+ DCs显著增加,同时绒毛和固有层CD3+、CD4+和CD8+T细胞也显著增加。说明TGEV强毒株感染的树突状细胞对灭活K88的摄取、迁移、递呈和刺激T细胞增殖的能力确实受到了损伤,而弱毒株感染的树突状细胞的这些免疫功能没有受到损伤。这些可以为研究TGEV强弱毒株的致病机制以及开发疫苗提供理论基础。