用转基因动物生产药用蛋白已取得突破性进展,具有广阔的应用前景。与哺乳动物的乳腺生物反应器相比,家禽输卵管作为生物反应器则具有个体小,产蛋量高,世代间隔小,易于规模化生产,禽蛋中蛋白含量相对较高等优势。但是基于禽类自身的生殖生理特点,鸡输卵管生物反应器的研究相对滞后,外源蛋白在输卵管中缺乏获得特异、高效率的表达调控手段。近几年,转基因家禽的制备在国内外多个研究机构取得了成功,如何使转基因家禽高效率的生产重组蛋白,已成为决定家禽生物反应器能否进入应用领域的关键。本实验拟筛选高效调控卵清蛋白基因表达的元件,并将其整合制备人工优化启动子,将能有效提高卵清蛋白的生产效率。本研究根据实验室已有结果,选取鸡输卵管卵清蛋白基因上游调控序列和第一内含子作为研究对象,对其进行表达载体构建和优化研究。本研究从以下几方面开展：1、鸡卵清蛋白基因上游调控序列表达载体的构建根据实验室已有结果对鸡卵清蛋白基因上游调控序列进行分析得出,-921-+38区域具有较高的表达活性,但失去了组织特异性,上游2.1kb具有较高的转录活性和组织特异性,3.1kb区域则具有更严密的组织特异性,长于3.1kb表达活性显著降低。根据分析结果,将-922～-2073和-2801～-3100区域平均分成12个长度约为150bp的序列,分别插入到-921～+38序列的上游,构建成荧光素酶基因报告载体。测序结果显示,成功构建12个系列表达载体,为进一步筛选短缩版优化启动子提供材料。2、迷你内含子变异报告载体的制备PCR扩增卵清蛋白基因-1338-+1640片段(A:Intron-contain)和-1338～+38片段(B:Intron-less),插入至荧光素酶报告载体,命名为pGL4-intron-contain、 pGL4-intron-less;设计在A载体基础上去除第一内含子,仅保留供体位点和受体位点的荧光素酶报告载体(C:Intron-delation),命名为pGL4-合成；然后在C载体中插入一级迷你内含子(约300bp)片段,分别命名为pGL4-mini intron-1、pGL4-mini intron-2、 pGL4-mini intron-3、pGL4-mini intron-4、pGL4-mini intron-5,制备成含一级迷你内含子的的多种变异报告载体。测序表明,成功构建上述载体,为筛选优化的迷你内含子提供必要的材料。3、鸡原代输卵管上皮细胞培养体系的建立。以初开产的母鸡作为材料,通过输卵管组织分离、胰蛋白酶消化、细胞纯化、转染前培养等技术环节的摸索,获得了原代鸡输卵管上皮细胞,为检测卵清蛋白基因启动子的组织特异性表达提供了试验平台。4、卵清蛋白启动子片段的表达活性及特异性检测。将二十种启动子-报告基因重组载体转染DF-1细胞进行了萤光素酶活性的检测,找出具有最强活性重组质粒pGL4-UP-1412和内含子重组质粒pGL4-mini-intron-3;同时推断出若干包含增强子序列区域。二十种启动子-报告基因重组载体在输卵管上皮细胞上转染后,荧光素酶基因表达活性测定结果与空白对照结果无显著性差异,有待进一步实验。