研究背景和研究目的结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。上皮细胞向间质细胞的转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)与肿瘤转移关系密切。在肿瘤中,肿瘤微环境可诱导发生EMT。炎性成分是恶性肿瘤微环境的一个重要组成部分。研究表明,巨噬细胞在肺纤维化进展过程中大量繁殖,并通过协调成纤维细胞和成肌纤维细胞活性来诱导上皮间质转化。有趣的是,在日常病理诊断中我们也发现在浸润性结直肠癌组织周围常常有大量巨噬细胞聚集。那么,在肿瘤微环境中,巨噬细胞是否也能促进结直肠癌细胞发生EMT呢?在大多数恶性肿瘤中,肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAM)是肿瘤间质中浸润最多的一类炎性细胞,具有促进肿瘤生长、侵袭、迁移、血管生成和转移等作用。TAM的功能作用具有时相性和组织特异性。在不同肿瘤组织、同种肿瘤的不同部位以及在同一肿瘤的不同发展阶段其功能亦有所不同。TAM在结直肠癌微环境中发挥的作用和机制尚不清楚。该项目通过探寻结直肠癌肿瘤微环境中存在的EMT诱因,鉴定调控EMT的关键分子及标记物,研究EMT与结直肠癌微环境中巨噬细胞的关系。该研究不仅对理解恶性肿瘤的形成、发展和转移的分子机制具有理论意义,对恶性肿瘤的诊断和治疗也具有实践意义。研究方法1 TAM在结直肠癌的分布、分型及对预后的影响采用免疫组织化学染色方法检测结直肠癌患者癌组织和配对的癌旁正常组织中CD68+、NOS2+和CD163+巨噬细胞的浸润密度,结合患者的临床病理特征和随访资料,探讨结直肠癌组织微环境中CD68+和CD163+巨噬细胞的浸润密度与结直肠癌患者的淋巴结转移、生存时间的关系,分析结直肠癌不同微环境中其浸润密度对患者预后的影响。2 2D-DIGE筛选TAM差异表达蛋白及其质谱鉴定以THP-1细胞和与结直肠癌细胞共培养后的M2THP-1细胞为研究对象,采用荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)筛选二者的差异蛋白点,并挑取差异蛋白点进行质谱鉴定。3细胞因子芯片筛选TAM诱导结直肠癌EMT相关细胞因子和验证以TAM和NM培养上清液为研究对象,采用细胞因子芯片筛选二者的差异因子,并利用免疫印迹技术和ELISA在蛋白和分泌水平对差异因子进行验证。4 TAM对结直肠癌EMT的影响(1)外周血单核细胞体外分化成巨噬细胞模型建立。Ficoll密度梯度离心法分离结直肠癌(CRC)患者外周血单个核细胞,经过贴壁培养,洗去未贴壁细胞,在培养液中加入20 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ继续培养3天后得到M1型巨噬细胞,而加入20ng/mlIL-4和20ng/mlIL-13继续培养3天后得到M2型巨噬细胞,再进行相关鉴定。(2) THP-1来源的不同亚型巨噬细胞模型建立。10 ng/ml的佛波酯(PMA)作用于人单核细胞白血病THP-1细胞24 h后得到Mφ细胞:去除PMA,培养基中加入20ng/ml LPS和20ng/ml IFN-γ继续培养3天后得到M1型细胞;加入20ng/mlIL-4和20ng/mlIL-13继续培养3天后得到M2型细胞;鉴定细胞表型并用于后续实验。(3)巨噬细胞与结直肠癌细胞间接共培养模型的建立。选择孔径为0.4μm的上室和6孔培养板(下室)建立起Transwell共培养系统。在下室内接种SW480或SW620细胞,4 h后在上室内接种各种活化表型的巨噬细胞进行间接共培养,观察结直肠癌细胞形态变化。(4) M2型巨噬细胞对结直肠癌细胞增殖能力的影响。使用CCK8法检测与不同亚型巨噬细胞共培养48h后的SW480或SW620细胞继续培养1、2、3、4、5、6、天的OD值。绘制细胞体外生长曲线。(5) M2型巨噬细胞对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。将1×105个SW480或SW620细胞用100μl无血清的RPMI-1640培养液重悬,混匀后接种于基质胶包被的孔径8μm的Transwell小室上室,下室接种5×104个不同亚型巨噬细胞,共培养24、48 h后进行固定、染色、计数。(6) M2型巨噬细胞对结直肠癌细胞EMT的影响。使用实时荧光定量、免疫荧光和免疫印迹法检测EMT相关基因和相关蛋白的表达变化。5结直肠癌微环境中TAM来源的galectin-1与结直肠癌侵袭转移的关系(1)选取10例结直肠癌新鲜组织,进行冰冻切片,采用免疫荧光双染法检测galectin-1和CD68及CD163的免疫共定位。(2)免疫组织化学法检测galectin-1在215例结直肠癌患者癌组织和配对的癌旁正常组织中的表达,结合患者的临床病理特征和随访资料,探讨galectin-1与结直肠癌患者的淋巴结转移、生存时间的关系,分析galectin-1对结直肠癌患者预后的影响。(3)设计galectin-1的干扰片段,合成SiRNA,转染M2 THP-1细胞。采用QRT-PCR和Western blot鉴定干扰后galectin-1在细胞中的表达;采用ELISA检测galectin-1干扰前后在M2 THP-1细胞的分泌量。(4)分别采用CCK8法、FN粘附实验和transwell小室实验观察galectin-1对结直肠癌SW620细胞增殖、粘附、侵袭和迁移能力的影响。(5)采用免疫荧光和western blot技术检测galectin-1对结直肠癌SW620细胞EMT的影响。6统计学分析所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料采用x±SD表示。CD68、CD163、galectin-1与临床病理学参数的相关性用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法,两组间比较采用Log-rank test。生存期的多因素分析采用Cox回归模型。CD68与CD163表达的相关性、galectin-1与CD68或CD163的相关性采用双变量相关分析。巨噬细胞不同亚型的鉴定、Transwell侵袭实验、结直肠癌细胞与巨噬细胞共培养后EMT相关基因的表达、galectin-1蛋白和分泌水平的检测结果比较均采用单因素方差分析或Welch分析,两两比较采用LSD或Tamhane’ s T2分析。CCK8增殖实验采用析因设计的方差分析,结直肠癌细胞与巨噬细胞共培养后EMT相关蛋白的荧光表达采用两样本T检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1 TAM在结直肠癌的分布、分型及对预后的影响CD68+和CD163+巨噬细胞在正常结直肠粘膜间质中少见,而在结直肠癌组织的侵袭边缘中,可见大量CD68+和CD163+巨噬细胞浸润。NOS2+巨噬细胞在结直肠正常粘膜间质中多见,在癌组织间质中少见。TAM在癌组织中的分布呈异质性,同一结直肠癌组织的不同部位CD68和CD163表达强度不一,主要位于癌巢周围的间质中。相关性分析的结果表明,CD68与CD163的表达呈正相关(rs=0.335, P<0.001)。用Log-Rank检验比较两组生存曲线的差异,结果显示,癌巢内CD68+TAM高密度组的总体生存时间优于CD68+TAM低密度组,差异具有统计学意义(Log rank=7.191,p=0.007)。用Log-Rank检验比较两组生存曲线的差异,结果显示,癌周CD163+ TAM高密度组的总体生存时间低于CD163+ TAM低密度组,差异具有统计学意义(Log rank=4.211,P=0.040)。多因素Cox比例风险模型的预后分析显示,癌周CD163+ TAM数量是影响预后的危险因素(P=0.010);癌周CD163+ TAM的相对危险度>1,表明癌周CD163高表达的患者预后较低表达的患者预后差(P<0.001)。2 2D-DIGE筛选TAM差异表达蛋白及其质谱鉴定2D-DIGE结果显示,未经处理的THP-1细胞和与结直肠癌细胞共培养后的M2型THP-1细胞,二者有多个差异表达的蛋白点,通过分析蛋白质表达量的差异,共筛选72个差异表达蛋白质点,其中与THP-1细胞相比,M2THP-1细胞中表达上调的蛋白质点45个,下调的蛋白质点27个。有效鉴定的蛋白点为21个,其中分泌蛋白有2个。3细胞因子芯片筛选TAM诱导结直肠癌EMT相关细胞因子和验证采用细胞因子芯片比较TAM和NM细胞培养上清液中的差异表达细胞因子,经分析发现,相比于NM细胞上清液,TAM细胞上清液中表达上调(比值大于1.5)的有188个,表达下调(比值小于0.50)有7个。综合2D-DIGE和细胞因子芯片的结果,我们选取了分泌型蛋白galectin-1作为后期研究对象。采用免疫印迹技术检测了 galectin-1蛋白在不同巨噬细胞中的表达水平。结果表明:galectin-1蛋白在M2 THP-1细胞和TAM的表达,均高于对照组细胞,差异具有统计学意义(F=140.954, P<0.001)。使用ELISA检测各组的galectin-1分泌量。SW620细胞、未经处理的THP-1和PBMC细胞几乎不分泌galectin-1,而M2 THP-1和M2 PBMC细胞galectin-1分泌量与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。TAM细胞分泌的galectin-1量为(117.47±9.52) ng/ml,与NM组(24.19±3.97) ng/ml比较差异具有统计学意义(P<0.001)。4 TAM对结直肠癌EMT的影响(1)将健康人外周血来源的单核细胞,用细胞因子刺激得到不同亚型巨噬细胞,用免疫荧光检测巨噬细胞广谱标志物CD68的表达,结果表明,约有95%以上的细胞为CD68+的巨噬细胞。(2)采用免疫荧光法检测CD68在不同亚型THP-1细胞的表达,发现THP-1细胞不表达或低表达CD68,而M1型、M2型巨噬细胞均高表达CD68。流式细胞术检测PBMC和THP-1来源的M2型巨噬细胞,发现M2型巨噬细胞均高表达CD11b和CD163两种标记物。(3)采用CCK8法检测SW480和SW620细胞与巨噬细胞共培养后增殖能力的改变,结果表明:与对照组细胞(SW480/Med)相比,与M1型巨噬细胞共培养后的SW480细胞从第2天开始,其体外增殖能力降低(P<0.001),与M2组细胞共培养的SW480细胞体外增殖能力与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与M1型巨噬细胞共培养后的SW620细胞从第2天开始,其体外增殖能力降低(P=0.011),与未处理的PBMC组细胞共培养的SW620细胞体外增殖能力无显著变化,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。而与M2组细胞共培养的SW620细胞从第3天开始,其体外增殖能力高于对照组细胞,差异具有统计学意义(P<0.001),其体外增殖能力高于对照组细胞。(4) Transwell侵袭实验的结果表明,SW480和SW620细胞与PBMC来源的巨噬细胞共培养之后,与巨噬细胞共培养后的各组与对照组相比差异具有统计学意义(F=272.184,P<0.001; F=115.052,P<0.001)。SW480 和SW620 细胞与原代TAM共培养后,其穿过膜的细胞增多,差异具有统计学意义(F=340.014,P<0.001; F=82.564,P<0.001)。表明巨噬细胞能够促进结直肠癌细胞的侵袭。(5)利用QRT-PCR检测发现SW480细胞与M2型巨噬细胞共培养后,SW480细胞的上皮性标志物E-cadherin、a-catenin、β-catenin的表达下调(P<0.001,P<0.001,P=0.003),间质性标志物vimentin表达明显上调(P<0.001),而转录因子snail、slug的表达也上调(P<0.001,P<0.001)。SW620细胞与M2型巨噬细胞共培养后,上皮性标志物E-cadherin、α-catenin、β-catenin和y-catenin的表达下调(P<0.001,P=0.002, P<0.001,P=0.003),间质性标志物vimentin 表达明显上调(P<0.001 ),而转录因子snail、slug和twist的表达也上调(P<0.001,P<0.001,P=0.001)。采用免疫荧光检测EMT相关蛋白的表达。结果显示结直肠癌细胞与M2型巨噬细胞共培养后,各蛋白表达差异具有统计学意义。上皮性标志物E-cadherin、ZO-1 和β-catenin 的表达降低(t=5.95,P=0.004; t=11.66,P<0.001; t=11.33,P<0.001),而间质性标志物N-cadherin 和vimentin (t=12.35,P<0.001 ;t=5.55,P=0.0.05)以及转录因子snail、slug 和TCF8 的表达升高(t=7.30,P=0.002;t=7.21,P=0.002; t=7.23, P=0.002)。5结直肠癌微环境中TAM来源的galectin-1与结直肠癌侵袭转移的关系(1)免疫荧光双染结果显示结直肠癌组织中galectin-1和CD68、galectin-1和CD163均具有共定位,在TAM的周围存在弥散的galectin-1,表明TAM能够表达和分泌galectin-1。(2)免疫组化结果显示,结直肠癌galectin-1的阳性率(83.7%)高于结直肠正常粘膜中的表达(18.6%),差异有统计学意义(P<0.001)。在结直肠癌中,galectin-1主要围绕在肿瘤细胞周围表达。我们发现在同一结直肠癌的不同部位galectin-1表达强度不一,呈梯度表达,在癌细胞侵袭边缘galectin-1细胞外基质表达明显高于癌巢内的表达。结果提示,结直肠癌的淋巴结转移、远处转移和Dukes分期对galectin-1表达的影响具有统计学意义(χ2=16.859, P<0.001;χ2=5.272, P=0.022;χ2=20.148, P<0.001)。患者性别、年龄、癌组织的大小、分化、浸润深度对galectin-1的表达影响无统计学意义(χ2分别为0.556, 1.746,1.143, 0.174,3.524;P值均>0.05)。用Log-Rank检验比较两组生存曲线的差异,结果显示,galectin-1低表达组的总体生存率优于galectin-1高表达组,差异具有统计学意义(Log Rank=9.644, P=0.002)。Galectin-1低表达组的总体生存率优于galectin-1高表达组。多因素Cox比例风险模型的预后分析显示,galectin-1是影响预后的危险因素(P=0.011); galectin-1的相对危险度>1,表明galectin-1高表达的患者预后较低表达的患者预后差(P--0.002)。将相同结直肠癌病例中galectin-1的表达与CD68或CD163的表达进行相关性分析,发现galectin-1与CD68和CD163的表达均呈正相关(rs=0.282,P=0.001; rs=0.365,P<0.001)。(3)利用QRT-PCR检测M2 THP-1细胞中galectin-1的干扰效率,发现干扰片段1和2的干扰效率分别为66%和73%,与未干扰组和Mock组相比差异具有统计学意义(P<0.001),表明干扰有效。Western blot检测表明,转染SiRNA-Galectin-1 的M2 细胞(M2/Si1和M2/Si2)与转染SiRNA-NC的M2 细胞(mock)相比,在蛋白水平galectin-1的表达量均降低。ELISA检测M2THP-1转染48h后上清液中galectin-1的分泌量,结果显示,M2THP-1干扰组细胞分泌的galectin-1比对照组减少(P<0.001)。(4) CCK8法检测galectin-1对结直肠癌细胞的增殖能力的影响。当浓度为1.0μg/ml 的 galectin-3 作用 48 h 后,该组 SW620 细胞 OD 值为(0.36±0.04),而对照组为(0.26±0.04),二者相比差异具有统计学意义(P=0.001)。但galectin-1对SW480细胞的增殖并无明显影响。(5)采用细胞计数的方法检测检测galectin-1对SW620细胞异质粘附能力的影响,发现 galectin-1 0.5μg/ml、galectin-1 1.0 μg/ml 和 galectin-3 1.0 μg/ml 作用后细胞的数量与对照组相比具有统计学意义(P<0.001)。SW620细胞与SiRNA-Galectin-1的M2/Si1和M2/Si2细胞共培养48 h后,其FN粘附能力较对照组的减弱,而与Medium组相比无显著差异(P=0.840,P=1.000)。(6)利用 Transwell 侵袭实验发现,1.0 μg/ml galectin-1 作用 SW620 细胞 48 h后,其穿膜细胞数与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。Galectin-1处理组为(20.00±2.83)个,高于对照组(3.50±1.05)和 0.5μg/mlgalectin-1 处理组(11.25±3.30)。(7)利用免疫荧光和western blot检测发现galectin-1作用于SW620细胞后,上皮性标志物E-cadherin、ZO-1和β-catenin的表达明显降低,而间质性标志物N-cadherin和vimentin以及转录因子snail、slug和TCF8的表达明显升高,提示galectin-1促进结直肠癌EMT的发生。结论1.结直肠癌组织中TAM主要为M2型。癌巢内CD68和癌周CD163均可作为结直肠癌独立的预后指标。2. M2型巨噬细胞能够诱导结直肠癌细胞发生EMT,促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭。3.结直肠癌组织中的TAM能够分泌galectin-1。Galectin-1能够促进结直肠癌细胞的增殖、异质粘附、运动和侵袭,可以作为结直肠癌患者预后的独立指标。结直肠癌细胞膜上CD326为galectin-1的特异性受体,CD326通过负性调节E-cadherin介导的黏附作用,并介导细胞骨架重构,从而使结直肠癌细胞发生EMT。本研究的创新之处1.证实了结直肠癌组织中肿瘤相关巨噬细胞主要为M2型,癌周M2型巨噬细胞与结直肠癌预后负相关。2.首次提出galectin-1在结直肠癌微环境中由肿瘤相关巨噬细胞分泌,证实galectin-1在结直肠癌微环境中发挥促侵袭和转移的作用。3.提出并验证肿瘤相关巨噬细胞来源的galectin-1位于结直肠癌细胞膜的受体为CD326, galectin-1与CD326结合,下调E-cadherin表达,引起细胞骨架重构,诱导结直肠癌细胞发生EMT从而参与结直肠癌转移。