论文部分内容阅读
月季(Rosa hvbrida)是世界著名的观赏植物,具有很高的观赏价值和经济价值。花色是其重要的观赏性状,然而,目前关于调节月季花色的MYB转录因子和MBW(MYB-bHLH-WD40)复合体研究较少,研究不够深入,其调控机制尚不清楚。本研究基于转录组数据分析发现一个关键R2R3-MYB转录因子RcMYB1,通过功能鉴定、蛋白互作验证和调控机制研究,揭示了 RcMYB1与RcbHLHs(RcbHLH42,RcEGL1)和RcTTG1形成的MBW复合体在月季花青素生物合成中起核心作用,并参与类胡萝卜素和芳香类化合物合成,获得的主要结果如下:1)RcMYB1编码一个SG6 R2R3 MYB转录因子。通过进化树和多序列比对分析显示RcMYB1在亚组6(SG6)中,包含典型的bHLH相互作用基序、ANDV基序和保守的R2R3 MYB DNA结合结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序。在月月粉花瓣着色期间(S1-S7),RcMYB1的表达趋势与花青素积累的趋势一致;在不同颜色的月季花中RcMYB1在红色月季中表达水平相对较高。2)RcMYB1在月季花青素合成中发挥关键作用。在白色月季‘加百列’花瓣小圆片中过表达RcMYB1后,发现花瓣小圆片中花青素含量显著增加,花青素生物合成基因(RcCHSa、RcCHSc、RcCHI、RcF3H、RcF3’H、RcDFR、RcANS、RcUFGT和RcGT1)的转录水平显著增加;在烟草叶片中过表达RcMYB1同样出现花青素的大量积累;而在沉默RcMYB1后,花青素积累则被显著抑制。进一步,在月季中进行了RcMYB1的稳定遗传并成功获得RcMYB1的过表达株系,表型观测结果显示,在RcMYB1-OE株系中,叶片和叶柄出现显著的花青素积累,花青素生物合成基因表达水平显著上调。3)RcMYB1 与 RcTTG1 和 RcbHLH42 或 RcEGL1 相互作用形成 MBW 复合体。在花青素调控中,MYB转录因子通常与bHLH和WD40蛋白形成MBW三元复合体进而调控花青素积累。为鉴定与RcMYB1形成MBW复合体的bHLH和WD40蛋白,构建了系统发育树,结果表明RcbHLHs(RcbHLH42和RcEGL1)和RcTTG1可能是参与花青素调控的bHLH和WD40蛋白。进一步、通过酵母双杂交(Y2H)、双荧光素酶互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)证实RcMYB1与两种bHLH蛋白(RcbHLH42和RcEGL1)和WD40蛋白RcTTG1相互作用,形成MBW复合体。4)两种MBW复合体以功能冗余的方式正调控花青素的积累。为明确两种MBW复合体是否参与花青素的积累,我们在月季小圆片和烟草叶片中进行了瞬时表达研究,结果显示,相较于单独过表达RcMYB1,过表达两种MBW复合体都能进一步促进花青素的积累,然而两种MBW复合体之间没有显著差异,可能以功能冗余的方式调控花青素合成。5)RcMYB1以自我激活的方式调控花青素生物合成基因。酵母单杂交(Y1H),双荧光素酶(LUC)和ChIP-qPCR分析表明,RcMYB1能够激活自身基因启动子,并广泛激活花青素早期和晚期合成基因启动子,而两个MBW复合体则进一步增强RcMYB1和晚期合成基因启动子活性。6)RcMYB1参与类胡萝卜素和挥发性芳香物的代谢,但不参与原花青素的代谢。由于发现RcMYB1在黄色(类胡萝卜素为主要呈色物质)和白色(较浓的香气)月季中存在较高表达水平,因此检测了 RcMYB1是否参与月季中原花青素、类胡萝卜素和芳香类化合物的代谢过程。过表达RcMYB1后,月季花瓣呈现更深的橙红色,UPLC测定α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量均显著增加;GC-TOFMS分析,发现花瓣中主要芳香物质苯丙素类和单萜类的相对含量显著提高。利用Y1H,LUC和ChIP-qPCR等试验,发现RcMYB1不参与调控原花青素生物合成中RcLAR和RcANR的转录,但能够直接激活类胡萝卜素生物合成基因RcLYCB、RcLYCE-1和RcLYCE-2的转录,香叶醇代谢途径中RcNUDX1以及丁香酚代谢途径中RcEGS1转录。结果表明RcMYB1不参与原花青素代谢,但能够激活类胡萝卜素和挥发性芳香物合成基因的转录。综上所述,在本研究中,我们发现一个关键的R2R3-MYB转录因子,RcMYB1,其不仅广泛参与花青素合成基因的转录调控,表明其在月季花青素积累调控中具有核心作用,此外,RcMYB1还参与类胡萝卜素和挥发性芳香物的代谢调控。进一步,我们还鉴定了两个与RcMYB1互作的MBW复合体,能够进一步增强RcMYB1在这些代谢过程中的调控作用。本研究结果为通过育种或遗传改良月季花色性状提供理论依据。