色谱微观过程研究对于色谱介质结构的精确设计和定向优化以及色谱操作过程优化有着极其重要的意义。虽然疏水、离子交换色谱技术得到了广泛的应用，但是，相关的机理解释仍然是有限的，因此作者开展了如下研究工作：一、利用荧光标记蛋白、激光共聚焦显微镜、H/D交换核磁共振等技术分别考察了不同孔径聚苯乙烯（PST）色谱介质介导的蛋白吸附、保留以及扩散情况。并从残基水平上给出蛋白质与PST疏水介质的微观作用机理以及宏观保留行为之间的关系。结论如下：1、蛋白质的吸附保留对大孔道介质并不敏感，这种敏感性只存在于介孔范围。随着孔径的不断增大，蛋白质色谱保留呈减小趋势，与介质结合力减弱，而扩散因子逐渐增大。2、吸附态溶菌酶残基信号丢失程度显著大于天然态；溶菌酶在14nm和30nm孔内表现出显著的信号损失情况，表明其结构去折叠严重。而120nm孔径，溶菌酶去折叠较弱，能保持其更紧凑结构避免氘代反应。二、考察了不同柔性蛋白在与阳离子交换介质（SP Sepharose FF）相互作用过程中色谱保留行为的差异。结论如下：带净电荷相等的蛋白质在离子交换色谱中，压缩因子ks越大的柔性蛋白色谱保留越强。并利用H/D交换核磁共振技术原位实时捕捉了阳离子交换多孔介质内的蛋白结构变化信息。蛋白表面静电势模拟计算结合氢氘标记的蛋白核核磁数据确定了三种蛋白与阳离子交换介质的作用位点。结论如下：1、三种蛋白吸附态残基酰胺氢信号的丢失都要多于天然态；且柔性越大的蛋白，其残基损失率越大。2、阳离子交换介质表面的静电基团是介导溶菌酶去折叠行为的主要机制。不同结构片段的去折叠程度不同，无规则卷曲（coil，bend，and turn）去折叠明显，二级结构域（α-helix，β-sheet）则得到保护。与疏水作用色谱相比，离子交换过程蛋白分子去折叠程度明显减弱。三、使用等温滴定量热法（ITC）测量得到不同柔性蛋白在IEC介质上吸附过程的热量变化，并计算得到吸附过程的吉布斯自由能变G，焓变H，熵变S，通过分析，结论如下：1、溶菌酶（LYS）和核糖核酸酶（RNA）在IEC介质上吸附的过程中发生了构象变化，并伴随热量释放，该过程对整个吸附的进行起着十分关键的作用，且柔性蛋白LYS放出的热大于刚性蛋白RNA。2、蛋白在阳离子交换介质表面的吸附是一个焓驱动的放热过程。